[发明专利]一组基因组合理简约化的伯克氏菌突变株与底盘菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株及其构建方法和其在β‑变形菌纲来源的天然产物的高效异源表达中的应用。其中所述基因组合理简约化的突变株是DT8，DT9和DT10，是连续删除转座酶、前噬菌体、基因组岛等细胞生长非必需基因，并在此基础上继续删除在该菌中本底表达的生物合成基因簇后获得。同时本发明通过在DT8，DT9和DT10基因组上定点插入phiC31attB位点构建了一组基因组合理简约化的伯克氏菌底盘菌株DT8‑attB，DT9‑attB和DT10‑attB，并实现了将所述底盘菌株应用于β‑变形菌纲中天然产物如埃博霉素的产量优化及隐秘生物合成基因簇的高效异源表达。有力扩展了革兰阴性菌异源宿主底盘菌，促进了细菌中新型天然产物的挖掘。

技术领域

本发明涉及一组基因重组的伯克氏菌及其构建与应用，尤其涉及一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株及其构建方法，和其在β-变形菌纲来源的天然产物的高效异源表达中的应用，属于微生物基因工程与生物化学领域。

背景技术

细菌是活性天然产物的重要来源。细菌基因组中含有大量的隐秘或“沉默”天然产物生物合成基因簇，其编码产物代表着生物活性代谢物的大量未勘探资源。受益于大型生物合成基因簇的克隆和组装策略的快速发展，生物合成基因簇的异源表达不仅成为优化目标化合物产量的有效方式，且是从基因组中挖掘隐秘次级代谢产物的优选策略。而对于革兰阴性细菌中的生物合成基因簇，缺乏高效的底盘菌仍然是实现基因簇异源表达的重要限制因素。

革兰阴性菌比如假单胞菌，粘细菌和伯克氏菌中的天然产物，被认为是一种具有生物活性潜力的新兴的、丰富的且尚未开发的化合物来源。充分开发革兰阴性细菌变形菌中丰富的生物合成潜力，需要构建一株具有稳健的生长特性、简便的遗传操作、较低的代谢背景和高产等特性的理想底盘菌株。

β-变形菌纲的细菌DSM 7029近期被重新分类为伯克氏菌(Schlegelellabrevitalea DSM7029)，已作为异源宿主以相对较高的产量表达粘细菌来源的非核糖体多肽/聚酮类天然产物，如埃博霉素(epothilone)和vioprolide。且这株菌具有关键的生物合成元件4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(4′-phosphopantetheinyl transferase)，并能够产生重要的聚酮延伸单元甲基丙二酰辅酶A(methylmalonyl-CoA)来高效合成聚酮类和非核糖体多肽类天然产物，因此具有成为β-变形菌纲来源的天然产物的异源宿主的巨大潜力，且前期已在该菌中建立了基于自身重组酶表达载体的高效遗传操作系统。但在之前的研究中，伯克氏菌(Schlegelella brevitalea)DSM 7029在发酵的早期即会出现明显的细胞自溶现象，显著影响了生物量并限制了目标化合物的异源表达产量。在培养基中添加大量蔗糖能够在一定程度上延缓细胞死亡并延长发酵周期，但是对于该菌中细胞自溶的机制与相关调节因子还没有得到研究。经检索，有关利用伯克氏菌DSM 7029自身重组酶表达载体pBBR1-Rha–RedG-BA 7029–Km介导的高效遗传操作系统，结合Cre/loxP位点特异性重组系统与SacB反向筛选系统对该菌进行合理基因组简约化，删除一些细胞生长假定调节基因和/或导致细胞裂解的自溶相关调控基因以延缓细胞自溶并提高生物量，以将伯克氏菌DSM7029优化为一株β-变形菌纲来源的生物合成基因簇高效异源表达宿主的文献还未见报道。

发明内容

针对现有革兰阴性菌中异源表达宿主的缺乏，本发明的目的是对伯克氏菌DSM7029基因组进行简约化，构建一组伯克氏菌基因组合理简约化突变株与一组基因组合理简约化伯克氏菌底盘菌株，和该底盘菌株在β-变形菌纲来源的天然产物产量优化方面与在β-变形菌纲来源的隐秘基因簇高效异源表达方面的应用。