[发明专利]苦楝树缩叶病毒全基因组序列及其检测方法

权利要求书

1.一种扩增引物在扩增苦楝树缩叶病毒全基因组序列中的应用，其特征在于，所述苦楝树缩叶病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示，所述扩增引物包括两对扩展引物对，其序列如下：

CLSV-1-F：CTGCTAACTGGTTCTCCTTTCC；

CLSV-1-R：GATCCTGCTACGGGAACAAC；

CLSV-2-F：GGGTAAGTCTTGTTGATTACATTACTG；

CLSV-2-R：CCAAATCTCTGTATGCCTGATC。

2.一种苦楝树缩叶病毒全基因组序列获取方法，其特征在于，所述苦楝树缩叶病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示，所述方法使用权利要求1所述扩增引物进行扩增，包括如下步骤：

1）抽提病毒侵染植物组织的总DNA；

2）采用所述扩增引物，以所述总DNA为模板，进行PCR扩增；

3）回收PCR扩增得到的DNA产物，并将其连接到pLB平末端载体，进行DNA测序，得到苦楝树缩叶病毒全基因组序列。

3.如权利要求2所述的苦楝树缩叶病毒全基因组序列获取方法，其特征在于，步骤2）PCR扩增的反应体系如下：

10×KOD-Plus-Neo buffer 5μL

2 mM dNTPs 5μL

25 mM MgSO₄ 3μL

上游引物10μM 1.5μL

下游引物10μM 1.5μL

KOD-Plus-Neo DNA 1.0μL

模板DNA 0.5-2μL

加dd H₂O至总体积为50μL；

所述PCR 的反应循环的设置如下：

98 ℃ 3 min

98 ℃ 10 sec

56℃ 10 sec

68 ℃ 2 min

30循环数

68 ℃ 5 min。

4.如权利要求2所述的苦楝树缩叶病毒全基因组序列获取方法，其特征在于，所述步骤（3）中，回收长度为3223 bp和3931bp的DNA产物；pLB平末端载体连接反应体系如下：

目的PCR片段 2μL

pLB Vector 1μL

2×Reaction Solution 5μL

T4 DNA Ligase 1μL

ddH₂O 1μL。

5.一种特异性检测引物在检测苦楝树缩叶病毒中的应用，其特征在于，所述苦楝树缩叶病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示，该病毒的全基因组序列包含编码gp1、gp2、gp3以及gpY四个蛋白的核苷酸序列，四个核苷酸序列分别如序列表SEQ NO:2-5所示，gp1、gp2、gp3以及gpY的氨基酸序列分别如SEQ NO:6-9所示；

所述特异性检测引物包括：

CLSV-d1-F：GAGAATGATGTATCCCACGG；

CLSV-d1-R：CCTGATCCTGAATATGTGTTGT。

6.一种检测苦楝树缩叶病毒的方法，其特征在于使用权利要求5所述检测引物进行PCR检测；所述苦楝树缩叶病毒全基因组序列如序列表SEQNO:1所示，该病毒的全基因组序列包含编码gp1、gp2、gp3以及gpY四个蛋白的核苷酸序列，四个核苷酸序列分别如序列表SEQNO:2-5所示，gp1、gp2、gp3以及gpY的氨基酸序列分别如SEQ NO:6-9所示。

7.如权利要求6所述检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取疑似感病的苦楝树总DNA；

(2)将步骤(1)终产物植物总DNA稀释到100ng/μl，用所述特异性检测引物进行普通定性PCR扩增；

(3)检测，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，用1kb DNA marker作为片段大小对照标准，根据电泳图确定检测结果。

8.如权利要求7所述检测方法，其特征在于，步骤（2）中的PCR体系如下：

2×Mix 10 μL

上游引物10 μM 1μL

下游引物10 μM 1 μL

DNA 1 μL

dd H₂O至总体积为 7 μL

PCR 反应循环的设置如下：

98℃ 3 min

98℃ 10 sec

56℃ 10 sec

72℃ 30 sec

30循环数

72℃ 5 min。