[发明专利]一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒素B1检测应用

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种自参比比率电化学生物传感器的构建方法及其黄曲霉毒素B1检测应用。首先将金纳米粒子修饰到玻碳电极表面，然后通过Au‑S键自组装sDNA，反应后再滴加MCH，经常温孵育封闭非特异性结合位点，然后，在电极表面引入携带Fc的适配体和辅助DNA，得到电化学生物传感器；在其表面修饰AFB1，通过测定传感器电流值，与AFB1浓度构建得到标准曲线；最后通过测定未知样品的电流值，代入构建的标准曲线，即可实现未知样品中AFB1的检测；本发明以单一的信号探针构建自参比比率传感器，得到更可靠更具有抗环境干扰能力的电化学信号，检测选择性好、速度快、灵敏度高。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于自参比比率电化学生物传感器的制备方法及其应用，可用于对真菌毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)检测。

背景技术

黄曲霉毒素(AFT)是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，广泛分布在花生、玉米等多种常见农作物中。其衍生物有约20种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中以B1的毒性最大，致癌性最强。黄曲霉毒素B1(AFB1)可诱导人体细胞的DNA突变，且是一种剧毒的致肝癌物质。AFB1不仅直接危害人类健康，动物食用含AFB1的饲料后其肝、肾、肌肉、血、奶及蛋也回携带毒素极微量毒素。因AFB1的危害及其在自然界广泛的分布，开发了许多公认的先进分析技术来检测AFB1，例如高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FL)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是，这些方法操作复杂，成本高，准确性不足或受存在假阳性结果的限制。因此，开发一种高效、灵敏的电化学传感平台是很有必要的。

电化学方法以其简单，快速响应和低成本等优点而受到了广泛的关注。目前有文献报道已经构建了用于灵敏检测AFT的各种电化学传感器，例如通过常规电化学方法相结合的双模式传感器；但是单信号输出容易受环境因素的影响，导致其灵敏度和精确度不足。

为了使真菌毒素检测的结果更加准确可靠，本发明构建了一种基于单一信号探针的自参比比率适配体传感器用于黄曲霉毒素B1的准确检测。

发明内容

本发明旨在提供一种检测速度快，可靠性高的电化学检测器件，用于直接检测AFB1。本发明使用金纳米粒子(AuNPs)作为基底材料，使基底DNA(sDNA)链在电极表面固定，携带Fc信号的适配体(Fc-Apt)和携带Fc信号的辅助DNA(Fc-aDNA)在电极上自组装。Fc-Apt与Fc-aDNA在电极表面按照一定比例自组装，用交流循环伏安法检测无目标物时的总电化学信号I_Fc⁰中，Fc-Apt产生的电流信号(记为I_Fc-Apt⁰)和Fc-aDNA产生的电流信号(记为I_Fc-aDNA⁰)的占比也是一定的。当目标物AFB1出现与Fc-Apt特异性识别并从电极表面剥离，Fc-aDNA作为参比探针不发生明显变化。即以Fc-aDNA为参比信号，用交流循环伏安法检测对应浓度目标物时的电化学信号I_Fc，再结合无目标物时确定的I_Fc-Apt⁰/I_Fc-aDNA⁰比率信号值，计算获得加入目标物后I_Fc-Apt/I_Fc-aDNA的比率信号值，通过I_Fc-Apt/I_Fc-aDNA比率信号值与目标物浓度之间的变化关系实现黄曲霉毒素B1的检测。

通过如下技术方案实现本发明的目的：

本发明首先提供一种基于自参比的比率电化学生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)首先制备得到AuNPs溶液；然后将基底DNA(sDNA)溶液和TCEP(三(2-羧乙基)磷酸酯)溶液混合，得到混合溶液A，使sDNA上的-SH充分活化；再将相同浓度的Fc-Apt溶液和Fc-aDNA溶液混合均匀，得到混合溶液B；