[发明专利]一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用

说明书

本发明公开了一种对PALM1基因进行RNAi以提高豆科牧草小叶数量的应用，其中所述PALM1基因是蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALMATA‑LIKE PENTAFOLIATA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述对PALM1基因进行RNAi的方法是：设计引物，通过RT‑PCR技术从紫花苜蓿中克隆PALM1基因；并为了避开该基因保守结构域，在其C端设计RNAi引物，扩增紫花苜蓿PALM1基因中如SEQ ID No.2所示的PALM1‑C‑RNAi片段，并将该片段转入载体pANDA35HK构建得到RNAi重组载体MsPALM1‑RNAi；然后进行遗传转化野生型紫花苜蓿野生型实验，通过愈伤再生的方式获得转基因MsPALM1‑RNAi株系，实现提高豆科牧草小叶数量。实验证实转基因植株的小叶数量显著提高，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物或后续的牧草品质改良，对我国草业生产具有重大意义和经济价值。

技术领域

本发明涉及一种改良豆科牧草品质基因的应用，尤其涉及一种对蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALM1(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)进行RNAi以提高豆科牧草(以紫花苜蓿为例)小叶数量的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

苜蓿是豆科牧草的一种，是当今世界分布最广的栽培牧草，也是最为重要的一种多年生优质牧草。随着我国草食畜牧业和奶业的快速发展，国内对于高质量苜蓿的需求日益增长。但是目前国产苜蓿存在产量少、品质差、货源不稳定等问题，国产苜蓿的短缺情况已经成为限制我国草食畜牧业和奶业发展的一个重要因素。因此苜蓿的产量和品质改良是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。

苜蓿的产草量是以收获叶和茎为主，叶最多可贡献产草量的60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要研究对象。由于叶片储藏了苜蓿70％的蛋白质，而且叶片纤维含量仅为茎秆的1/3，因此叶茎比值越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。所以在苜蓿品质的评价体系中，叶茎比(叶片与茎秆重量的比值)是其中一个重要的指标。而选育叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是苜蓿育种工作者追求的目标。目前苜蓿叶片增多的性状已被作为一种形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降的一种基因编辑技术。

植物的叶发育模式分为单叶和复叶。单叶结构指得是在一个叶柄上只有一个小叶片，而复叶结构指得是在一个叶柄上有多个小叶片生成。蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括三个小叶片。据已有的报道，三叶发育模式是由PALM1基因(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)决定的。发明人利用蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的基因组高度相似性，克隆了紫花苜蓿的PALM1基因(MsPALM1)，并构建RNAi载体转化野生型紫花苜蓿(SY4D)，通过遗传转化技术获得了MsPALM1-RNAi转基因株系，并对MsPALM1-RNAi在复叶物种中调控小叶片数目进行了研究。经检索，有关在紫花苜蓿中获得PALM1基因的RNAi株系以及关于MsPALM1-RNAi在复叶物种中调控小叶片数目的应用目前还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种对蒺藜苜蓿三叶发育模式关键基因PALM1(PALMATA-LIKE PENTAFOLIATA1)进行RNAi以提高豆科牧草(以紫花苜蓿为例)小叶数量的应用。