[发明专利]一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针组合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好，适用于热对流PCR并且能够进行多重检测的引物探针组合。使用本发明的试剂盒及检测方法，基于热对流PCR，可实现超快速PCR扩增检测，而且检测灵敏度极高。

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种利用热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是猪的一种高度传染性病毒病，致死率接近100％。非洲猪瘟病毒是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》年版，被列为法定报告的疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”。

感染非洲猪瘟病毒的家猪会出现致命的出血热，目前尚无有效的疫苗可进行防御。对疾病控制的唯一的确切可用方法是对疫区的隔离同时对疫区内的猪进行屠宰然后无害化销毁，并花费大量的人力对疫区的传播媒介(蜱虫等)进行扑灭。自从1909年肯尼亚首次报道发现非洲猪瘟病毒，非洲猪瘟病毒已经肆虐非洲，欧洲，亚洲，美洲等150多个国家。

家猪肉类是我国主要的肉类食物，自2018年非洲猪瘟病毒在我国沈阳首次被发现以来，我国家猪养殖业受到严重影响，猪肉价格频频上涨，加重了国民负担。非洲猪瘟病毒是一种传染性极强的病毒，早发现、早隔离就尤为重要。

目前，市场已有的非洲猪瘟核酸检测方法对实验环境要求较高，检测时间较长，无法进行现场检测。因此亟需研发出一种灵敏度高、特异性好且可现场快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于热对流PCR平台，定性检测非洲猪瘟病毒的引物、探针、试剂盒及方法。具有实验过程简单、快速、实时等优点。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

内标引物对，所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.3所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种多重检测非洲猪瘟病毒核酸的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内标探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种基于热对流PCR检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重组分：qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、无核酸酶水、ASFV裂解试剂、阳性质控品、内标溶液。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含序列如SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸。

在另一优选例中，所述第一容器还包含qPCR缓冲液(qPCR-Buffer)、和 /或无核酸酶水。