[发明专利]编码重组UNG酶及其纯化工艺

说明书

本发明公开了一种编码重组UNG酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组UNG酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码出的UNG酶具有较强的活性，该UNG酶编码基因在大肠杆菌中能高效可溶表达，通过两步纯化工艺即可获得纯度较高的重组UNG酶。

技术领域：

本发明属于生化技术领域，特别涉及一种编码重组UNG酶及其纯化工艺。

背景技术：

目前，PCR技术在临床检测及疾病防控等多个领域均有着极为广泛的应用。但由于PCR扩增过程中，核酸被放大至少上百万倍(20个循环)，因此少许PCR产物所形成的气溶胶足以造成污染，导致假阳性扩增。在PCR操作过程中，最容易出现“污染”问题，主要原因有如下几种情况：1.模板的交叉污染：在样品采集或处理中，气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染，造成假阳性，属于正常DNA(由A、T、C、G四种碱基组成)引起的污染；2.扩增产物的污染：在扩增过程中，由于产物量特别大，容易溢漏引起污染，造成假阳性；3.核酸酶、蛋白酶的污染造成假阳性。在这三种情况中最为严重是第二种，即称之为“残留污染”，因为PCR扩增的放大倍数高达千万倍，而且在实际应用中扩增一直在反复进行，造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光定量PCR也很难避免扩增产物的污染，为了使得PCR结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后于管内通过酶或其他方法将操作过程中可能带入的残留污染物清除，使其不能成为新一轮扩增的模板。

为解决由PCR产物带来的假阳性现象，尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）被大量应用于核酸扩增中。UDG的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。UDG是细胞内DNA损伤修复系统中一种重要的组分，在自然界广泛存在，包括细菌、真核生物、人细胞中都有UDG酶表达。UDG在PCR防污染方面具有非常重要的作用。PCR反应最常见，最重要的污染物是PCR扩增产物污染。因为PCR灵敏度非常高，可到单拷贝。因此如果即使痕量的扩增产物污染了模板，也会导致假阳性出现。

目前常用的做法是在PCR反应体系中加入UDG酶，并以dUTP取代dTTP，这样PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加一步较低温度的孵育步骤，UDG酶即可将反应体系中可能存在的上一轮的含有U-DNA的扩增产物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性和准确性。UNG酶自身会在PCR的预变性步骤后失活,不会再降解新扩增的产物U-DNA。这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的污染，避免假阳性的出现，这种技术叫做UNG/dUTP防污染技术。目前市售的UNG酶主要以基因工程技术制备的重组UNG酶为主，但普遍存在着表达量不高或者重组UNG酶活性不高的问题。在PCR体系中，使用dUTP替代dTTP，带有dUTP的单链或双链DNA会被UNG酶降解，而不会消化不含dUTP的单链或双链DNA。通过这种方式，第一轮产生的带dUTP的PCR产物会被UNG酶降解，不会作为模板对第二轮PCR产生假阳性影响。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种UNG酶的编码基因，从而克服上述现有技术中的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种编码重组UNG酶的基因，其碱基序列如SEQ IDNO：2所示，重组UNG酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种包含了如上文所述编码重组UNG的基因的载体，载体为pET15b。

一种包含了如上文所述载体的大肠杆菌宿主菌株，大肠杆菌宿主菌株为BL21(DE3)。

一种重组UNG酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。