[发明专利]编码重组UNG酶及其纯化工艺

权利要求书

1.一种编码重组UNG酶的基因，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组UNG酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种包含了权利要求1所述编码重组UNG的基因的载体，其特征在于：所述载体为pET15b。

3.一种包含了权利要求2所述载体的大肠杆菌宿主菌株，其特征在于：所述大肠杆菌宿主菌株为BL21(DE3)。

4.一种重组UNG酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.一种UNG酶在大肠杆菌中高效可溶表达方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1挑取一个含有权利要求3所述的大肠杆菌菌株单菌落，接入LB培养液，适当温度培养过夜；

S2取适量过夜培养物接入LB培养液中，适当温度下震荡培养至对数中期OD600为0.6-0.8；

S3在培养物中加入1mM IPTG，于适当温度下震荡过夜诱导表达，适当温度下离心收集含有重组UNG酶的大肠杆菌菌体沉淀。

6.根据权利要求5所述的UNG酶在大肠杆菌中高效可溶表达方法，其特征在于：所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50mg/L。

7.一种重组UNG酶的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1将收集得到的含有诱导重组UNG酶大肠杆菌菌体沉淀；

S2吸去上清，菌种加入适量裂解液搅拌，获得足量的破碎菌体；

S3破碎菌体于冰浴中超声，取上清液离心，上清液滤除固体颗粒；

S4将上清液经过层析柱流穿后，以平衡液和10%洗脱液分别清洗样品；

S5当杂蛋白洗脱完全后，用100%洗脱液进行UDG酶洗脱收集；

S7将收集到的样品用离子柱A液稀释并流穿已经平衡好的阴离子柱，以离子柱A液洗脱杂蛋白完全后，用100 %洗脱液进行洗脱及收集，UV ≥ 50收集，UV 100停止收集。

8.根据权利要求7所述的重组UNG酶的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1将收集得到的含有诱导重组UNG酶大肠杆菌菌体沉淀；

S2吸去上清，100g菌种加1600ml裂解液置于5L烧杯中，放到磁力搅拌器上进行搅拌裂解，800rpm搅拌裂解30min；

S3破碎菌体，于冰浴中超声，超声条件：超声4 s，停止5 s，变幅杆功率为50% 于细胞超声破碎仪中超声30 min；取上步上清液置于贝克曼AllegraTM 25R Centrifug离心机中以13000 rpm 离心12 min。

9.待离心完成后，将上清液通过0.22 um 滤膜过滤；

S4将上述样品以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的层析柱，待样品流穿完全后，以平衡液以4 ml/min流速洗杂蛋白的，当杂蛋白洗脱完全后，用10%洗脱液进行再次洗杂；

S5当杂蛋白洗脱完全后，用100%洗脱液进行UDG酶洗脱收集；

S6将上述样品用离子柱A液稀释50倍（电导：2.0 cons），以2.5 ml/min 流速流穿已经平衡好的阴离子柱，以5-10个柱体积的离子柱A液以4 ml/min流速洗杂蛋白的，当杂蛋白洗脱完全后，用100 %离子柱B液进行洗脱及收集，UV=50收集，UV100停止收集。

10.根据权利要求7或8所述的重组UNG酶的纯化方法，其特征在于：

裂解液配制品组分：20 mM Tris-Hcl，500 mM NaCl，10 mM 咪唑；

洗脱液配制品组分：20 mM Tris-Hcl，50 mM NaCl，400 mM 咪唑；

离子柱A液配制品组分：20 mM Tris-Hcl; 200 mM NaCl; PH:8；

离子柱B液配制品组分：20 mM Tris-Hcl; 1 M NaCl; PH:8。

11.重组UNG酶在预防非特异性PCR扩增和污染、保证PCR结果准确性中的应用。