[发明专利]一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法

说明书

本发明公开了一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法。该监测方法包括以下步骤：1)标准参照长棘海星幼虫DNA模板制作；2)珊瑚礁区浮游动物物样品的过滤收集；3)珊瑚礁区收集浮游动物样品DNA的提取；4)浮游动物样品PCR扩增及检测。PCR检测中采用了一对长棘海星PCR检测的的特异引物。正向引物：AcanP‑TF:GCACGATTTGTCTCTGCCAA；反向引物：AcanP‑TR:AGTCCTTCTCTCGCCAGGT。如果在785bp处有目的条带为长棘海星幼虫阳性，如果没有则阴性。通过本发明的方法可以对长棘海星幼虫进行监测，可以提前对长棘海星种群爆发的风险进行预警，从而达到更早期、及时防控的目的。

技术领域：

本发明属于生物分子标记定量监测技术领域，具体涉及一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法。

背景技术：

珊瑚是热带海洋中重要的生物资源，对于维护海洋生态系统具有重要意义。长棘海星是一种主要以珊瑚为食的棘皮动物，长棘海星食量大、破坏力强，其种群爆发可造成珊瑚礁大面积死亡，因此长棘海星被认为是对珊瑚破坏力最大的敌害生物。如何防控长棘海星成为珊瑚礁管理工作者最为关注的问题之一。在实践中发现，当发现大量长棘海星成体出现时，珊瑚礁已经从底部开始受到破坏，因此缺乏更早的预警方法，达到早期发现，防患于未然的目的。对长棘海星幼虫的监测，可以提前预警种群爆发的风险，从而达到更早期、及时防控的目的。然而到目前为止，国内外均未见对长棘海星幼虫进行监测的方法。

在中国海域长棘海星的性成熟的高峰为6-9月份，雌体海星单次产卵量高达300万枚，因此即使少数长棘海星能够产卵，单次也可产生数亿规模的长棘海星幼体。长棘海星幼体最长时间的阶段主要营浮游生活，通过我们观察发现，从原肠胚期开始，其体长就达到200μm以上，这为去除原生动物、微藻等大部分浮游生物，快速在珊瑚礁区海水中快速收集长棘海星幼体提供了便利条件。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一对鉴别长棘海星幼虫的检测引物。

本发明的鉴别长棘海星幼虫的检测引物，包括：

正向引物：AcanP-TF:GCACGATTTGTCTCTGCCAA，序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物：AcanP-TR:AGTCCTTCTCTCGCCAGGT，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法，其包括以下步骤：

1)标准参照长棘海星幼虫DNA模板制作；2)珊瑚礁区浮游动物样品的过滤收集；3)珊瑚礁区收集浮游动物样品DNA的提取；4)浮游动物样品PCR扩增及检测，PCR检测中采用了上述引物，如果在785bp处有目的条带，则为长棘海星幼虫阳性，如果没有则阴性。

优选，所述的长棘海星幼虫参照DNA模板，是设有多个梯度的标准长棘海星幼虫参照DNA阳性模板，可以根据海水样品DNA扩增后与标准参照DNA模板扩增后目的条带的亮度，检测采集点的幼虫密度。

优选，所述的珊瑚礁区浮游动物样品的过滤收集是采用浅水2型浮游生物网进行珊瑚礁区海水中浮游动物样品的采集，样品采集深度为0.5-10m，过滤水体后，从外部冲洗，将浮游动物浓缩于网的底部，收集海水，得到样品海水；将尼龙滤膜(100μm/50mm)用镊子，装入滤器当中，采用注射器抽取样品海水，过滤于滤膜上，过滤完后，取出滤膜，表面喷淋一层95％的酒精到湿润既可，放到采样管或离心管中保存。

优选，所述的DNA的提取是用无菌镊子取出附着有浮游动物样品的滤膜，用吹风机的冷风吹干滤膜，采用无菌剪刀将滤膜剪碎，连同滤膜一起采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取滤膜上生物样品的DNA，采用10mM Tris-Cl缓冲液洗脱，保存，得到DNA。