[发明专利]一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法

权利要求书

1.一种珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）标准参照长棘海星幼虫DNA模板制作；2）珊瑚礁区浮游动物样品的过滤收集；3）珊瑚礁区收集浮游动物样品DNA的提取；4）浮游动物样品PCR扩增及检测，PCR检测中采用了鉴别长棘海星幼虫的检测引物，如果在785bp处有目的条带为长棘海星幼虫阳性，如果没有则阴性；

所述的鉴别长棘海星幼虫的检测引物，包括：正向引物：AcanP-TF:GCACGATTTGTCTCTGCCAA；反向引物：AcanP-TR: AGTCCTTCTCTCGCCAGGT；

所述的珊瑚礁区浮游动物样品的过滤收集是采用浅水2型浮游生物网进行珊瑚礁区海水中浮游动物样品的采集，样品采集深度为0.5-10m，过滤水体后，从外部冲洗，将浮游动物浓缩于网的底部，收集海水，得到样品海水；将100μm/50mm规格的尼龙滤膜用镊子，装入滤器当中，采用注射器抽取样品海水，过滤于滤膜上，过滤完后，取出滤膜，表面喷淋一层95%的酒精到湿润既可，放到采样管或离心管中保存；

所述的DNA的提取是用无菌镊子取出附着有浮游动物样品的滤膜，用吹风机的冷风吹干滤膜，采用无菌剪刀将滤膜剪碎，连同滤膜一起采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取滤膜上生物样品的DNA，采用10mM Tris-Cl缓冲液洗脱，保存，得到DNA；

所述的PCR，其PCR体系是25μL反应体系，包括：DNA模板0.5μL, AcanP-TF/TR各0.5μL,ddH₂0 11μL, 2× Premix rTaq 12.5μL；

所述的PCR，其PCR反应程序是94℃ 4min；94℃ 20sec, 62℃ 30sec, 72℃ 1min, 32cycles; 72℃ 5min。

2.根据权利要求1所述的珊瑚礁区长棘海星幼虫分子监测方法，其特征在于，标准参照长棘海星幼虫DNA阳性模板设有多个梯度，根据海水样品与标准参照目的条带的亮度，检测采集点的长棘海星幼虫密度。