[发明专利]一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒

说明书

本发明公开了一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒，属于工业生物技术领域。本发明提供如SEQ ID NO.1所示的菌体密度依赖型自诱导启动子。本发明提供的启动子能够有效调控宿主细胞的生长和角蛋白酶的表达过程，使菌体密度提高了50％，酶活力最高可达到3500U·mLsupgt;‑1/supgt;，是对照菌的2.9倍。本发明通过使用菌体密度依赖型启动子有效调控了产酶工程菌的生长与产酶过程，减少产酶对宿主的影响，从而提高菌体量及产酶量。本发明为工业上生产角蛋白酶等宿主毒性蛋白酶类提供了有效的解决方法。

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，尤其是指一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒。

背景技术

启动子是控制外源蛋白表达的最重要的元件之一，可以调节靶基因的表达时间和水平。就初始转录条件而言，现有的天然启动子一般可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和生长时期特异性启动子。强组成型启动子多用于实现高水平表达，而诱导型启动子和生长时期特异性启动子实现了对表达时间和表达水平的控制，是生产具有宿主毒性蛋白的较好选择。相比于依赖诱导剂的诱导性启动子，时期特异性启动子依赖于细胞密度启动基因表达。启动子PaprE特异性在对数末期表达；PsrfA特异性在对数末期和稳定期表达。这两种启动子在菌体达到最大生物量之前几乎不启动或极弱的启动基因的表达，有利于菌体的生长和积累；达到对数末期或稳定期，能够快速诱导基因表达，有利于目的产物的生产。

角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。随着对角蛋白酶研究的深入，研究者们发现角蛋白酶的表达具有一定的宿主毒性，其过量表达和积累可能会降解宿主内多种功能性蛋白从而破坏其正常生长与代谢过程，影响产酶菌体数量进而降低目的产物的产量。然而针对该问题，国内外文献中尚未报道有效的解决方法。因此，角蛋白酶的高效表达成为其工业化大规模生产的瓶颈问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒。本发明基于启动子工程改造策略调控宿主菌的生长与产酶过程，分别选用时期特异性启动子、拷贝数优化以及核心区序列改造构建出一种提升菌体生长和角蛋白酶产酶潜力的基因表达盒，有效提高了产酶菌体量及角蛋白酶的产量和活性。

一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子为菌体密度依赖型自诱导启动子。

一种基因表达盒，所述基因表达盒包括所述的启动子，以及以所述启动子启动表达的角蛋白酶基因。

在本发明的一个实施例中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2具有95％以上同源性的核苷酸序列。

一种基因表达盒的载体质粒。

在本发明的一个实施例中，所述载体为适于芽孢杆菌表达的载体。

一种表达角蛋白酶的重组菌，所述重组菌以所述的启动子启动表达角蛋白酶基因。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌的宿主为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增启动子序列，并将两个拷贝数的启动子序列进行串联、将-35区的ATGATA突变为TTGACA、将-10区的TAAAAT突变为TATAAT，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子；