[发明专利]一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，解决了现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，所述用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，包括引物合成、目的基因的获取与扩增、重组表达质粒的构建、恙虫病东方体相关蛋白的诱导表达、Western blot试验、重组蛋白表达形式分析、重组蛋白纯化等步骤。本发明设计了一种恙虫病东方体47kDa蛋白获取的方法，通过探索调整蛋白诱导表达条件及蛋白纯化方法，成功体外诱导表达恙虫病东方体相关47kDa蛋白，同时提高体外蛋白的纯度，得到纯度＞85%。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法。

背景技术

恙虫病是一种自然疫源性疾病，又称丛林性斑疹伤寒，由专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的一种容易被忽略的潜在的致命感染性疾病，恙虫病每年发生100万余例，已有研究发现，恙虫病如果没有接受及时的治疗，病死率的发生很可能大于登革热而达到10%的病死率，尤其在患者还未接受抗生素治疗的时候，该病的死亡率甚至可以高达40%-45%。

恙虫病东方体寄生于恙螨，人被恙螨叮咬后，在人体血管内皮细胞生长、繁殖，其潜伏期一般为7-21天，临床表现主要有寒战、发热等非特异性症状，重症感染表现为感染性休克、弥散性血管内凝血甚至死亡。而恙虫病由于起病初期的非特异性症状很难与其他发热性疾病如发热伴血小板减少综合征、流行性出血热等疾病鉴别，所以，目前对于恙虫病相关致病机制的研究报道几乎依旧处于空白领域。虽然随着研究的不断深入，PCR和血清学检测及敏感抗生素的治疗得以发展，但快速准确的高敏感性和特异性的诊断方法及疫苗的研究依旧具有重要的意义。

恙虫病东方体（丛林性斑疹伤寒）47kDa蛋白属于HtrA热休克蛋白家族，且其高度保守，恙虫病东方体不同菌株的同源性为＞97%，在致命攻击小鼠模型中对4株异源菌株具有良好的同源保护和交叉保护，因此，似乎是广泛预防恙虫病东方体感染的良好候选疫苗。恙虫病患者的血清已经被证明可以识别几种恙虫病东方体的抗原，其主要外膜56-kDa蛋白，占立克次体细胞蛋白总含量的10-15%。现阶段对于恙虫病东方体47kDa蛋白对机体的致病机制的研究人员较多，但是，如何稳定于体外获得纯度较高的恙虫病东方体相关蛋白一直是一个难点，目前尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件。基于上述陈述，本发明提出了一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，而提出的一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法。

一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体相关致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长；

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体47kDa蛋白，通过overlapPcr扩增47kDa蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，反应完成后，将全长PCR二轮产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段备用；

（3）pET30a-47重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2-3分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养12-14h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达：将经过测序同时保存的重组菌菌液，于37℃， 220r/min震荡培养至菌液D600为0.6-0.8时，加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；