[发明专利]一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法

权利要求书

1.一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体相关致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长；

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体47kDa蛋白，通过overlapPcr扩增47kDa蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，反应完成后，将全长PCR二轮产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段备用；

（3）pET30a-47重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2-3分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养12-14h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达：将经过测序同时保存的重组菌菌液，于37℃，220r/min震荡培养至菌液D600为0.6-0.8时，加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；

（5）Western blot 试验：使用步骤（4）中的蛋白样品，以12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，将蛋白转移至硝酸纤维素膜5%脱脂乳封闭1h，鼠源His抗体孵育过夜，PBST洗涤4次，每次5min，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗涤4次，5min每次，显影；

（6）恙虫病东方体47kDa重组蛋白表达形式分析：复苏步骤（3）中保存的重组菌，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，4000r/min离心10min，收取上清，用PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验；

（7）恙虫病东方体47kDa重组蛋白纯化：复苏47kDa蛋白相关的重组菌，转移到1L培养基中，37℃条件下振荡培养至菌液D600为0.6-0.8,加入0.2mM-0.4mM的IPTG进行诱导表达，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，制备蛋白样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果；

（8）通过上述流程，成功于体外诱导表达纯化获取了大量纯度较高的恙虫病东方体47kDa重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中全长PCR一轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH₂O 38ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1-30各0.5ul。

3.根据权利要求1所述的一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中全长PCR一轮反应扩增条件为：95℃预变性 3 min;95℃变性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25个循环；72℃延伸1 min。

4.根据权利要求1所述的一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中全长PCR二轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH₂O37.2ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1 0.5ul,引物300.5ul。

5.根据权利要求1所述的一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中全长PCR二轮扩增条件为：95℃预变性 3 min;95℃变性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25个循环；72℃延伸1 min。