[发明专利]一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用。该DNAzyme探针，包含酶链H1、底物链H2、酶链H3和底物链H4。该DNAzyme探针可以特异性识别目标核酸，实现基于DNAzyme的指数级信号放大，反应动力学提高，检测限降低，仅为0.15fM，相比传统的DNAzyme探针检测限降低了3个数量级(传统的DNAzyme探针检测限为0.2pM)，同时，检测灵敏度比传统的DNAzyme探针提高了1333倍，即本发明提供的DNAzyme探针灵敏度高、检测限低、特异性强。并且具有更优的反应动力学。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组检测核酸的DNAzyme探针及其应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的，长度约为19-22个碱基的的非编码短链RNA，可以调节多种生物过程，包括细胞分化，细胞增殖和凋亡等。miRNAs的异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关，因此，miRNA被作为癌症的诊断标志物和治疗靶点。发展miRNA的高灵敏高特异性定量检测方法对疾病诊断和了解疾病的发生发展至关重要，特别是活细胞内miRNA的成像更具吸引力，因为其可以避免复杂的提取过程，保证细胞的活性，且能为癌症相关miRNAs表达的研究提供可视化时间和空间方面的信息。

miRNA的表达水平较低，且同源相似度高。实现高灵敏高特异性miRNA分析是一大难点。基于此，研究者提出了多种恒温核酸扩增技术用于构建更高灵敏度的检测方法，如滚环扩增(RCA)、环介导指数扩增(LAMP)、恒温指数扩增(EXPAR)，这些酶参与的扩增方法效率高，但生物酶昂贵且受检测环境影响较大，检测准确度较低。同时生物酶难以转染进活细胞，这些方法不适用于活细胞内miRNA分析。无酶参与的恒温扩增包括杂交链反应(HCR)、催化发夹自组装反应(CHA)和DNAzyme切割扩增反应等，这些方法摆脱了生物酶的干扰，准确度高，被广泛用于细胞内外核酸分析，其中DNAzyme切割扩增反应由于较低的背景信号和较快的反应速率受到较多的关注。

DNAzyme是一类在金属离子存在的条件下特异性切割底物RNA链的脱氧核苷酸，具有无限切割底物和可循环靶标回收特点，已被广泛应用于构建一对多的信号放大策略。然而目前的DNAzyme扩增主要是线性扩增模式，切割效率低下，成像灵敏度相对较低，无法满足活细胞内的低表达水平miRNA的原位成像分析。虽然许多研究者通过将DNAzyme与RCA,CHA,HCR等联合使用以提高方法的扩增效率，但是这些方法存在设计复杂、耗时、操作困难等缺陷且方法大多仍为简单线性扩增的级联，扩增效率仍然有待提高，发展更高扩增效率的miRNA分析方法仍旧是一大挑战。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一组检测核酸的DNAzyme探针。

本发明第二方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米颗粒。

本发明第三方面的目的，在于提供一种检测核酸的纳米颗粒的制备方法。

本发明第四方面的目的，在于提供一种检测核酸的试剂盒。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的DNAzyme探针、本发明第二方面的纳米颗粒、或第四方面的试剂盒在非疾病诊断用途的核酸检测中的应用。

本发明第六方面的目的，在于提供一种非疾病诊断用途的核酸检测方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一组检测核酸的DNAzyme探针，包含：酶链H1、底物链H2、酶链H3和底物链H4；

所述酶链H1从5’到3’依次包括：A序列、B序列、C序列、D序列和E序列；

所述E序列与目标核酸互补；

所述D序列为TAG、AAG、ATG、TTG或GCG；优选地，所述D序列为TAG；