[发明专利]一种快速检测胞内聚羟基脂肪酸酯含量的方法

说明书

本发明公开了一种PHA含量的检测方法，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表达，计算得到PHA含量。该检测方法快速准确，PhaP蛋白的标记物荧光蛋白的荧光强度可以即时检测获取，从而计算得到PHA含量；检测范围广泛，能够对多种PHA类物质进行含量检测，不仅适用于于天然的PHA生产菌株中，还能够迁移到非天然的PHA生产菌株中使用；检测成本价格低廉，采用分光光度计得到FI和OD₆₀₀两个参数，结合单个细胞的平均荧光值和PHA平均含量及其与细胞数目的关系，通过数学拟合的方式，便能计算出菌体中的PHA含量；适合大规模快速生产实时定量检测的需要，能够实时定量测定发酵罐中菌株生产的PHA。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种聚羟基脂肪酸酯（PHA）含量的检测方法。

背景技术

PHA是生物细胞内一类具有相似结构的功能性聚酯，作为能源储备物质广泛存在于微生物的细胞中。由于PHA的力学性质和热塑性质与聚乙烯、聚丙乙烯具有相似性，因而可以开发利用为高分子材料。除此之外，PHA还具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是一种环境友好型生物基高分子材料，在包装产业、有机农业、医学材料以及先进传感器研发方面具有重要的应用前景。

根据PHA侧链的长短不同，可将PHA分为三种类型：(1)短链PHA，如聚羟基丁酸酯（PHB）、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物（PHBV），单体含3-5个碳原子。(2)中长链PHA，如聚羟基己酸酯（PHHx）、聚羟基辛酸酯（PHO），单体含6个以上碳原子。(3)含短链与中长链单体的PHA，多是两种或两种以上单体的随机共聚物。

PHA颗粒表面结合蛋白PhaP（以下简称PhaP）广泛存在于各种PHA合成菌中，用于胞内PHA颗粒的包裹，并且PhaP蛋白的表达量受到PHA合成的调控，是PHA合成量的天然指示。虽然PhaP蛋白不是PHA合成所必需的，但会直接影响PHA包含体颗粒的尺寸大小和PHA合成积累的速率，在某些菌种中，如Ralstonia eutropha中，PhaP1的量受到调控且能够正比于胞内PHA的含量。

PHA由微生物菌种发酵获得，目前工业级的PHA生产高度依赖高效产PHA的微生物菌种，其胞内PHA的含量是衡量发酵质量的重要指标，高含量的PHA不仅证明发酵质量良好，且降低了下游提取PHA的难度。

气相色谱检测法是检测PHA的标准方法，通过该方法可以准确的获知胞内PHA含量和组成，但是过程繁琐且会产生含有有机氯的废液，不利于环境保护。在气相色谱分析法下，菌体首先要进行离心，洗涤并冷冻干燥，将干燥后的菌体称重后，再和甲醇-氯仿在酸性环境下100℃反应4小时左右，再经过萃取除去甲醇后，将有机相进入气相色谱仪进行分析（Braunegg等,European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology., 6(1978)29-37）。气相色谱分析法对于分析PHA生产而言，耗时长且无法对发酵中的样品中的PHA含量进行实时监测并指导发酵策略的调整，不适应大规模快速生产实时定量的需要。

尼罗红荧光技术是另一种定量检测PHB的方法（Degelau等,AppliedMicrobiology and Biotechnology., 42(1995)653-657）。尼罗红很容易在悬浮液中穿透细胞，短时间内即可对胞内PHB含量进行检测，经尼罗红染色后的细胞的荧光强度与PHB浓度呈正相关关系。但是，该方法的敏感度低，特别是在菌种发酵PHB的初始阶段，发酵菌株还未积累足够量的PHB，可能会出现染色不够彻底的情况，且对染色条件有较强的依赖性，容易出现假阳性等情况。

现有技术中，对PHA含量的测定一直采用耗时昂贵或精确度比较低的方法。气相色谱检测法中，对样品的提取较为费时费力，需要较长时间的样品前处理过程，对操作人员的熟练程度也有较高的要求，从细胞中提取得到的PHA必须用氯仿处理一段时间，这一过程产生的含有有机氯的废液，还会对环境造成污染；尼罗红荧光技术敏感度低，特别是在菌种发酵PHA的初始阶段，发酵菌株还未积累足够量的PHA，可能会出现染色不够彻底的情况，导致检测结果不够精确。