[发明专利]一种快速检测胞内聚羟基脂肪酸酯含量的方法

权利要求书

1.一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括检测PhaP蛋白的表达，所述的检测PhaP蛋白的表达包括将编码荧光蛋白的基因与编码PhaP蛋白的基因融合表达后，通过检测荧光蛋白得到PhaP蛋白的表达量，PhaP蛋白的标记物荧光蛋白的荧光强度与PHA含量正相关，通过数学拟合的方式，计算得到PHA含量。

2.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的荧光蛋白选自绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP和黄色荧光蛋白YFP中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达后，通过检测所述荧光蛋白的荧光强度，得到PhaP蛋白的表达量。

4.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测方法应用于生产PHA的微生物中。

5.根据权利要求4所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的生产PHA的微生物选自：天然的PHA生产菌株、天然的PHA生产菌株突变体和非天然的PHA生产菌株中的一种或两种以上的组合。

6.根据权利要求5所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的天然的PHA生产菌株和天然的PHA生产菌株突变体选自：Ralstoniaeutropha，Halomonasbluephagenesis和Halomonascampaniensis中的一种或两种以上的组合；所述的非天然的PHA生产菌株选自搭建了PHA生产系统的异源菌株。

7.根据权利要求5所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的非天然的PHA生产菌株为Escherichia coli。

8.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的PhaP蛋白为天然的或修饰后的PhaP蛋白，其中，天然的PhaP蛋白选自：PhaP1和PhaP2中的一种或两种以上的组合。

9.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的PHA为天然或非天然聚羟基脂肪酸酯，所述的天然或非天然聚酯包括聚3-羟基丁酸酯（PHB）、3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯（P3HB-co-4HB）、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯（P3HB-co-3HHx）、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）、聚羟基己酸酯（PHHx）和聚羟基辛酸酯（PHO）中的一种或两种以上的组合。

10.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测标记物包括通过荧光分光光度法、紫外分光光度法、流式细胞仪荧光分析法、显微荧光定量法、全内反射荧光分析法和双光子荧光分析法中的一种或两种以上的组合进行检测。

11.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的检测标记物为通过荧光分光光度法、紫外分光光度法和流式细胞仪荧光分析法中的一种或两种以上的组合进行检测。

12.根据权利要求1所述的一种PHA含量的检测方法，其特征在于，所述的编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达的具体步骤为：

（1）、构建质粒：在phaP蛋白基因的下游非编码区设计向导RNA，然后通过Gibson法将表达荧光蛋白的基因片段gfp或rfp或yfp与pSEVA341骨架、向导RNA和上下游同源臂连接，构建质粒；

（2）、细菌接合实现基因编辑：首先将包含有Cas9蛋白且具有氯霉素抗性的质粒接合转移到生产PHA的细菌中，然后将步骤（1）所得质粒也接合转移到所述菌中，再通过包含氯霉素和壮观霉素的平板筛选同时含有Cas9蛋白和同源臂质粒的菌，通过phaP蛋白基因上下游的引物验证是否基因编辑成功，最后将基因编辑成功的细菌在没有抗性的培养基中传代培养至质粒丢失，最终得到编码PhaP蛋白的基因与编码荧光蛋白的基因融合表达的细菌。