[发明专利]一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用

说明书

本发明属于海藻分子遗传学领域，涉及一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用。浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记扩增引物；浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。本发明是通过PCR检测上述的特异性片段来完成，利用该特异性分子标记，可以快速、简单、准确地对引发黄海大规模绿潮的浒苔漂浮生态型进行分子鉴定，为黄海浒苔绿潮的早期预警、过程跟踪以及浒苔漂浮生态型向其他生境的扩散入侵监测提供重要的分子工具。

技术领域

本发明属于海藻分子遗传学领域，涉及一种浒苔漂浮生态型叶绿体基因组特异分子标记及其应用。

背景技术

绿潮（green tide）是大型海洋绿藻生物量暴发增殖的海洋生态现象，构成绿潮的海藻主要来自绿藻门（Chlorophyta）的石莼属（Ulva）。自2007年以来，黄海海域已连续15年于春夏季暴发大规模绿潮，生物量峰值超过百万吨鲜重、影响海区面积超过5万平方公里，漂移距离超过500公里，造成严重生态影响和经济损失，已成为稳定发生的海洋灾害。

为了开展黄海绿潮溯源、建立预警预报的科学方法，首先需明确绿潮藻优势种的组成规律。由于石莼属绿藻可用于形态分类的特征较少且很不稳定，因此常用分子方法开展物种鉴定。使用细胞核基因组编码的ITS（internal transcribed spacer）以及叶绿体基因组编码的rbc L（large subunit of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco）等序列标记，结合形态学观察，已确定黄海绿潮的优势种为浒苔（Ulva prolifera = Enteromorpha prolifera）。由于浒苔在我国沿海各海区广泛分布，存在很多自然生长的定生群体，因此，仅在物种水平开展分子鉴定，无法确定其可能的地理源头，不能满足溯源工作的要求。

鉴于此，进一步开展了种下水平的群体遗传学研究，利用ISSR（inter-simplesequence repeat）方法，分析了连续多年的黄海绿潮漂浮样本、以及广泛地理来源的定生群体，结果表明，漂浮浒苔无论群体内还是年际间均具有高度的遗传均一性，提示很可能来自单一的群体；而定生样本在群体间有着不同水平的遗传距离，表现出不同程度的遗传隔离；尤其重要的是，漂浮群体与所有定生群体间存在明显差异，说明漂浮群体并非由沿海的定生群体脱离固着汇聚而成，而是有着特殊生活方式、占据特殊的生态位。

为了实现对漂浮群体进行快速准确地分子鉴定，选择漂浮群体特异的ISSR扩增条带，经测序、设计开发了特异性扩增引物，发展了SCAR（Sequence CharacterizedAmplified Region）分子标记，该标记仅在漂浮群体样本中呈现一条830bp的特征性扩增条带，而在浒苔岸基定生群体和近缘种中则表现阴性结果。与岸基定生群体相比，鉴于漂浮群体具有明显的种下基因型差异，独特的形态与生理表型特征，尤其占据特殊的生态位，研究者提出黄海绿潮是由浒苔一个新的“漂浮生态型”（floating ecotype）构成。

大量研究表明，远离海岸、位于苏北辐射沙洲的大面积条斑紫菜养殖筏架与绠绳，成为石莼属绿藻大量附生的重要基质；另外，伴随紫菜收获以及筏架、绠绳回收清理的生产活动，使得附生绿藻被集中清理入海，可能成为每年黄海绿潮的重要源头。利用SCAR标记，已证实漂浮生态型可在筏架绿藻中检出，并进一步追踪了其在绿潮过程中的动态变化、评估了其向岸基扩散以及北侵的风险。

尽管SCAR标记具有突出的特异性，但根据漂浮浒苔基因组序列（NCBI序列号：GCA004138255），分析发现SCAR标记为细胞核基因组编码的单拷贝的分子标记。由于拷贝数极低，阳性样本的成功扩增高度依赖于海藻样本较好的生理状态、以及高质量总DNA模板的制备。因此，在对大量样本进行检测时，会产生一定比例假阴性的结果，需要对阴性样本重复检测以进行确认。