[发明专利]一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用。所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I‑SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I‑SceI识别位点和FRT位点。实验证明，本发明的同源重组系统的重组效率优于传统λ‑Red系统的双质粒和阿拉伯糖诱导方法，无需任何化学诱导剂，仅通过改变培养温度，即可实现染色体的高效编辑。而且避免了多次电穿孔过程，极大降低了操作复杂度并节省了时间和成本。本发明的提出为基因编辑提供了一种更加快速、简便、经济的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用，本发明属于基因工程技术领域。

背景技术

对基因组进行快速编辑改造具有十分重要的意义。同源重组是应用最广泛的基因编辑手段，基于该原理发展而来的内源性重组系统和λ-Red重组系统已被广泛应用于微生物染色体的各种修饰，如沙门氏菌和大肠杆菌。内源性同源重组大多需要RecA蛋白参与，通常需要在负责打靶的自杀质粒中插入数百碱基甚至更长的同源序列。RecA介导的反应是一个费时费力的过程，而且重组效率很低。另外，RecA系统的重组功能总是处在激活状态，会导致意外重排的现象发生。经典λ-Red重组系统包含来自于λ噬菌体的三种重要重组相关蛋白(统称为Red重组酶)：exo、beta和gam。Exo是一种核酸外切酶，可产生单链DNA，参与DNA链的入侵和同化反应。Beta是一种单链DNA退火蛋白，并促进互补ssDNA的复性，还可以促进链交换。Gam蛋白可以与RecBCD蛋白结合并抑制它们与双链DNA末端的结合。这三种蛋白协同作用，来实现细菌基因组的同源重组。该方法最早被应用于大肠杆菌K-12的基因敲除，操作流程是首先将pKD46质粒转化宿主菌，诱导表达Red重组酶；再以pKD3或pKD4为模板进行PCR扩增，将得到的带有侧翼同源序列(一般为30-50bp)的PCR产物转入宿主细胞，筛选阳性克隆；最后将pCP20质粒电穿孔入宿主细胞，产生FLP重组酶，消除抗性基因。该系统的重组效率优于内源性同源重组系统，但操作过程涉及L-阿拉伯糖诱导和多次转化细胞，较为繁琐耗时，而且用线性DNA片段进行打靶时，转化效率很低，有一些基因很难被敲除。此外，同源臂的长度较短也会降低重组效率。

最近报道了一种基于I-SceI的λ-Red重组系统，I-SceI是一种核酸内切酶，其识别的18bp独特序列仅存在于酵母线粒体中。该系统由供体质粒和辅助质粒组成，供体质粒中的打靶片段两侧带有I-SceI位点；辅助质粒则带有阿拉伯糖操纵子和编码Red重组酶和I-SceI核酸内切酶基因。当L-阿拉伯糖存在时，辅助质粒表达I-SceI核酸酶，切割供体质粒以释放打靶片段，同时Red重组酶促进了宿主染色体双链断裂和同源序列的重组，实现基因编辑。该系统使用较长的同源臂并在体内产生线性DNA打靶片段，因而其重组效率优于经典λ-Red重组系统，但涉及到多种质粒的协助、L-阿拉伯糖的诱导以及需要多次转化宿主细胞，操作环节依旧较多。

本发明将温控元件、Red重组酶基因、I-SceI内切酶基因和打靶片段区集成到单一质粒中，构建了一种新颖的温控自剪切单质粒同源重组系统。该质粒在基因编辑中能够发挥多种作用，一方面具有辅助质粒的功能，I-SceI识别位点两侧均带有多克隆位点，方便同源臂序列的插入，可以作为打靶片段区；另一方面具有工具质粒的功能，当温度升至42℃时，温控元件启动I-SceI内切酶和Red重组酶的顺序表达，并进行严谨控制，I-SceI内切酶识别并切割质粒上的独特位点，释放线性打靶片段，Red重组酶促进了打靶片段与基因组同源区域的交换，从而实现高效的同源重组。该系统无需任何昂贵的化学诱导剂，只需改变培养温度，即可实现染色体的高效编辑。而且避免了多次电穿孔过程，极大减少了操作环节，降低了实验成本。

发明内容

针对使用同源重组系统进行基因编辑过程中容易出现的问题，本发明的目的在于提供一种更加快速、简便和经济的同源重组系统及其构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：