[发明专利]一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用

权利要求书

1.一种温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括用于进行基因编辑的单质粒，所述的质粒命名为pKID220，所述的pKID220质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有筛选标记的打靶片段区，其中，所述的筛选标记的两侧均带有I-SceI识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)。

2.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为抗生素抗性基因或其他符合目的的筛选标记。

3.如权利要求1所述的同源重组系统，其特征在于，所述的筛选标记为氯霉素，所述的其他符合目的的筛选标记包括蔗糖、荧光蛋白。

4.如权利要求3所述的同源重组系统，其特征在于，所述的pKID220质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种构建权利要求1-4任一项所述的同源重组系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以pDC质粒为骨架，所述的pDC质粒携带的氯霉素抗性基因盒两侧有I-SceI内切酶识别位点和FLP酶识别靶点(FRT)，所述的pDC质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以pBV220质粒为模板，用pDCprpL-F和pDCprpL-R引物扩增得到1483bp的温控元件CIts857-P_RP_L片段，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将该片段通过Nhe I位点克隆到pDC质粒中，得到重组质粒，命名为pDC-CItsPRPL；引物序列如下：

pDCprpL-F：GAGTAAACTTGGTCTGACAGTCACATGTTCTTTCCTGCGT

pDCprpL-R：TTTCGGGGAAATGTGGCTAGCCCTCCTTAATTTTTAACCAA

2)通过PCR的方式扩增或者合成出含有编码I-SceI内切酶和Red重组酶的核酸片段，命名为I-SceI-Gam-bet-exo，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过NheⅠ位点将该I-SceI-Gam-bet-exo片段克隆到pDC-CItsPRPL中，最终获得的重组质粒，命名为pKID220。

6.权利要求1-4任一项所述的同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，优选的，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。

7.一种用于敲除靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括在权利要求1-4任一项中所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲除靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。

8.一种用于敲入或替换靶基因的温控自剪切单质粒同源重组系统，其特征在于，所述的系统包括在权利要求1-4任一项中所述的pKID220质粒基础上进一步构建得到的用于进行敲入或替换靶基因的质粒，所述的质粒中含有温控元件、Red重组酶基因、I-SceI核酸内切酶基因和含有以下核心元件的打靶片段区，其中所述打靶片段区按照基因敲入或替换靶基因的方向依次包括以下核心元件：I-SceI识别位点、基因敲除靶基因上游同源臂、敲入或替换基因、FRT位点、氯霉素抗性基因盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂、I-SceI识别位点。

9.权利要求7或8所述的同源重组系统在对微生物基因组进行基因编辑及改造中的应用，优选的，所述的微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述的基因编辑及改造包括对微生物基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换。

10.一种对沙门氏菌菌株基因组进行编辑改造的方法，所述的编辑改造包括对沙门氏菌菌株基因组中的特定基因进行敲除、敲入或替换，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求3或4中所述的质粒通过电转的方法转入沙门氏菌中，提质粒，测序验证；

(2)将含有所述质粒的阳性菌株接种于1mL含25μg/mL氯霉素的液体培养基中，30℃180rpm振荡培养4h；

(3)将培养物置于42℃振荡培养过夜；

(4)划线于含25μg/mL氯霉素的平板上，37℃孵育7～10h；

(5)菌落PCR筛选得到含氯霉素抗性基因的重组菌株；

(6)将pCP20质粒通过电穿孔转化含抗性基因的重组菌株，30℃培养于含100μg/mL氨苄青霉素的平板；

(7)挑取单菌落30℃培养8h后，升温至42℃，培养过夜；

(8)将培养物划线于LB平板，37℃培养；

(9)菌落PCR筛选得到无抗性且基因组经过编辑改造的重组沙门氏菌菌株。