[发明专利]一种高效分离猪肺炎支原体的方法

说明书

本发明涉及支原体的分离，公开了一种高效分离猪肺炎支原体的方法。本发明高效分离猪肺炎支原体的方法为使用含左氧氟沙星的培养基对猪肺炎支原体进行纯化培养，其中左氧氟沙星的浓度为50‑200μg/mL。本发明发现了左氧氟沙星在一定浓度范围内能明显抑制了猪鼻支原体的生长而不影响猪肺支原体的生长，可用含左氧氟沙星的培养基对猪肺支原体进行纯化、减少猪鼻支原体的污染。通过本发明发方法分离猪肺炎支原体的效率可以达到50％左右，远远高于传统方法分离纯化方法。

技术领域

本发明涉及支原体的分离，具体涉及一种高效分离猪肺炎支原体的方法。

背景技术

支原体属于柔膜体纲，其细胞形态结构多数为球型，大小(直径在0.3-0.8μm之间)介于病毒和细菌之间，是一类缺乏细胞壁的原核生物。支原体是可以在无细胞培养基中自我增殖的最小微生物，由于支原体在进化过程中，丢失了与生物合成途径相关的基因，导致支原体生长所需的必需物质氨基酸、嘌呤和嘧啶及细胞膜组成成分必须从它们生长的环境中摄取，因此支原体对体外培养条件要求非常苛刻，直到目前为止多数种类的支原体仍然无法在体外生长。

猪肺炎支原体是一种胞外病原体，能够黏附到猪肺组织的气管或支气管上皮细胞纤毛，调节先天性和适应性免疫系统，从而逃逸宿主的防御机制，建立起慢性且持久的感染。猪肺炎支原体细胞呈圆形或椭圆形，其直径分布在0.5-0.8μm之间，只特异性感染猪，是引起猪呼吸道疾病的重要病原之一。猪群一旦被猪肺炎支原体感染，想要将其根除将变得非常复杂和困难。在实际生产中，用于防控猪肺炎支原体引起感染的主要手段是接种疫苗。然而在临床上，成功将猪肺炎支原体从猪肺组织中分离的机率很小，因此在目前的疫苗生产中可供选择的候选菌种有限(目前国内使用的猪肺炎支原体灭活疫苗菌种主要来自国外)。而且已有的商业化疫苗只能提供部分保护，并不能阻止猪肺炎支原体在宿主体内的增殖。因此，开展对生长特性好且免疫原性高的猪肺炎支原体菌株的分离纯化工作，将显得尤为重要。

猪肺炎支原体在1965年首次被鉴别，直到1975年专门用于分离培养猪肺炎支原体的培养基才被报道。然而临床样本中通常含有快速生长的猪鼻支原体，猪鼻支原体的快速生长可以竞争性消耗生长环境中的营养成分，导致分离过程中培养的猪肺炎支原体数量越来越少，最终分离培养基中只能鉴定到猪鼻支原体，绝大多数情况下猪肺炎支原体的分离都会以猪鼻支原体的过快生长而告终。由于分离猪肺炎支原体过程中猪鼻支原体的存在，而且缺乏有效去除猪鼻支原体的方法，严重阻碍了猪肺炎支原体的分离纯化工作。到目前为止，国内外研究认为对猪肺炎支原体的分离培养仍然很复杂，而且不易成功，目前仅有8株完整的猪肺炎支原体全基因组被NCBI报道。由于缺乏高效分离猪肺炎支原体的方法，极大阻碍临床致病株的分离，由于有限的菌株，限制了猪肺炎支原体有效抗原的筛选、诊断分子的开发及有效防控策略的制定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种高效分离猪肺炎支原体的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种高效分离猪肺炎支原体的方法，为使用含左氧氟沙星的培养基对猪肺炎支原体进行纯化培养。

优选的，所述的纯化培养为通过传代培养进行纯化；所述的传代培养的次数优选为六代，在第四代时转接比例为1:10000～1:100000。

优选的，所述的高效分离猪肺炎支原体的方法包括如下步骤：

(1)将取自患有呼吸道疾病的病猪肺组织的样本处理后转接到培养基中培养。

(2)步骤(1)的样本培养六天后，将第一代培养物转接到新的含左氧氟沙星的液体培养基中进行第二代培养，以此类推；第六代培养产物涂到含左氧氟沙星的固体培养基上，待长出单克隆后，用接种丝挑取单菌落在固体培养基上划线，待长出新的单菌落，再重新挑取单菌落划线，重复多次，最后挑取单克隆于液体培养基中，即分离纯化到猪肺炎支原体。