[发明专利]一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法

说明书

本发明公开一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，包括以下步骤：将配置好的星形胶质细胞接种于芯片上层；将配置好的人脑微血管内皮细胞倒置接种于芯片下层；将芯片置于配套的精密摇床以此来模拟人体血管内的流体剪切力；对所述双层共培养芯片进行连续培养以使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至血脑屏障结构形成。本发明提供的技术方案，成功构建了体外血脑屏障模型，更准确、更接近的反应了体内血脑屏障的特征，可以用于AAV跨越血脑屏障的相关研究。本发明添加流体剪切力，更符合体内真实环境，且可实现高通量、减少细胞和试剂的消耗量。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及体外双层细胞动态共培养构建血脑屏障模型以及使用该模型进行腺相关病毒跨越血脑屏障相关研究。

背景技术

中枢神经系统疾病是最难治疗的疾病之一，其相关的致残率很高，通常难以完全治愈，治疗困难的主要原因是因为血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)的存在。血脑屏障是一种选择性渗透屏障，其选择性地限制或阻断许多亲水分子或大分子的透过。因此，血脑屏障在保护脑组织的同时也限制了许多治疗药物的输送，严重影响治疗效果。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)作为载体已成为基因治疗的重要组成部分，因为它无毒、免疫原性低、可在体内持续表达。AAV载体的特性使其成为基因治疗中枢神经系统疾病的候选基因载体。目前发现的AAV载体血清型中仅有少数几类如AAV9、AAVrh10等，可以跨过血脑屏障进入神经端，但其为全身转导型，不具有靶向性，因此跨越效率不高，治疗效果受限，且跨越机理尚不明确。

建立高保真血脑屏障模型对血脑屏障功能研究以及对AAV跨越血脑屏障的相关研究具有重要意义。目前血脑屏障模型分为体内模型和体外模型两大类。体内模型直接利用整个活体生物，其优势在于可以反映BBB环境的复杂性，但体内模型存在成本高、实验周期长、伦理问题等缺点。体外模型具有成本低、简单易控、模型相对稳定、适合高通量筛选的特点。体外血脑屏障模型多建立在静态二维培养系统中，但该模型无法复制BBB的剪切力等关键特征。

发明内容

本发明旨在提供一种体外动态双层共培养构建血脑屏障模型的方法，该模型可用于腺相关病毒跨越血脑屏障的相关研究。

具体的，本发明实现上述目的的具体方案如下：

一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，所述的方法包括以下步骤：

1)使用一芯片，所述的芯片设有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之间采用多孔滤膜隔开，所述的多孔滤膜孔径小于待培养细胞直径，厚度5-20μm；脑微血管内皮细胞培养于下腔室内，星形胶质细胞培养于上腔室内；

2)芯片预处理：将鼠尾胶原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；

3)细胞接种与培养：将星形胶质细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片上腔室，静置于培养箱1-3h后向芯片内补充星形胶质细胞培养基；每隔20-25h换液一次；

将脑微血管内皮细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片下腔室，倒置于培养箱使其贴附于多孔滤膜界面上，1.5-2.5h后翻转芯片，向芯片内补充DMEM高糖培养基；

将芯片置于配套精密摇床上连续动态培养，芯片在向上和向下分别和水平面呈30度角的范围内上下摆动)，1-3circle/min，通过重力作用驱动流体流动，实现无泵、连续恒定灌流，每隔20-25h换液一次，

4)使脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至屏障形成，即对应生成模拟的血脑屏障；；

5)将腺相关病毒加入，研究腺相关病毒跨越血脑屏障特性。

优选地，在研究腺相关病毒跨越血脑屏障效率和机制需多个实验组时，该芯片可达到240组实验同步进行；