[发明专利]一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法

权利要求书

1.一种腺相关病毒跨越血脑屏障模型的构建方法，所述的方法包括以下步骤：

1)使用一芯片，所述的芯片设有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之间采用多孔滤膜隔开，所述的多孔滤膜孔径小于待培养细胞直径，厚度5-20μm；脑微血管内皮细胞培养于下腔室内，星形胶质细胞培养于上腔室内；

2)芯片预处理：将鼠尾胶原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；

3)细胞接种与培养：将星形胶质细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片上腔室，静置于培养箱1-3h后向芯片内补充星形胶质细胞培养基；

将芯片置于配套精密摇床上动态培养45-55h，每隔20-25h换液一次；

将脑微血管内皮细胞消化后调整至适宜浓度，接种于芯片下腔室，倒置于培养箱使其贴附于多孔滤膜界面上，1.5-2.5h后翻转芯片，向芯片内补充DMEM高糖培养基；

将芯片置于配套精密摇床上连续动态培养，芯片在向上和向下分别和水平面呈30度角的范围内上下摆动，1-3转/min，通过重力作用驱动流体流动，实现无泵、连续恒定灌流；每隔20-25h换液一次；

4)脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长至屏障形成，即对应生成模拟的血脑屏障；

5)将腺相关病毒加入，研究腺相关病毒跨越血脑屏障特性。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞来源于人类细胞。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述脑微血管内皮细胞为永生化脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)、脑微血管内皮细胞(HBMEC)或从人多能干细胞(ips)诱导分化而来的细胞中的至少一种。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞配制成对应细胞悬液步骤中：

将星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞分别使用星形胶质细胞培养基和DMEM高糖培养基进行复苏培养，当细胞融合度达到80-90％时，分别消化星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞，对应获得星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞悬液，其中：

所述复苏培养条件为：培养温度37℃、CO₂浓度5％、培养湿度95％。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，

所述星形胶质细胞悬液浓度为2.5×10⁶cells/mL，注入量为每孔10μL；

所述脑微血管内皮细胞消化后调整悬液浓度为1×10⁷cells/mL，注入量为每孔10μL。

6.如权利要求1中所述的构建方法，其特征在于，步骤4)中，待细胞生长良好，屏障功能形成进行步骤5)之前，先对模型屏障功能表进行表征。

7.如权利要求6中所述的构建方法，其特征在于，表征过程如下：

跨膜电阻值，使用细胞电阻仪从模型构建第一天开始每隔24h对其电阻值进行一次测定；

免疫荧光，常规免疫荧光染色操作，ZO-1免疫染色，表征血脑屏障紧密连接情况；

小分子渗透，使用小分子荧光物质，分析小分子物质的渗透性，表征血脑屏障模型的渗透性。

8.如权利要求1中所述的构建方法，其特征在于，步骤5)中，过程如下：

分析各血清型腺相关病毒跨越血脑屏障效率，将各血清型腺相关病毒加入芯片下腔室，上腔室补充DMEM高糖培养基；

各种血清型腺相关病毒浓度为1×10¹⁰GC/mL，每孔加入量为200μL，上腔室补充DMEM高糖培养基100μL；

在定期从器官芯片上腔室取样，同时补充DMEM高糖培养基，用实时荧光定量PCR(qPCR)对样品进行测定，分析各类AAV的跨越效率。

9.如权利要求8中所述的构建方法，其特征在于，所述各种血清型腺相关病毒为2型腺相关病毒(AAV2)、9型腺相关病毒(AAV9)以及重组腺相关病毒AAV-PHP.eB。

10.如权利要求8中所述的构建方法，其特征在于，所述的定期为在12h、24h、36h、48h从芯片上腔室中取样。