[发明专利]一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，包括(1)外植体芦竹花穗的处理；(2)愈伤组织的增殖；(3)农杆菌的培养；(4)侵染与共培养；(5)筛选培养；(6)分化培养；(7)生根培养。本发明首次利用芦竹花穗诱导愈伤组织通过农杆菌介导法建立了芦竹的遗传转化体系,成功实现了以芦竹花穗愈伤组织为外植体的受体材料，通过农杆菌介导及后期筛选，成功获得含有GuS基因的转基因植株，为芦竹转基因工程提供研究基础。

技术领域

本发明涉及植物组织培养及遗传转化，具体涉及一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外 植体遗传转化方法。

背景技术

芦竹属禾本科,芦竹属,其为芦竹属惟一广泛分布的种，植株高大直立，根系发达，为多年生丛生草本植物。芦竹由于生物量大,适应性强,分布范围广,能够在边际土地生长，非常有潜力成为缓解我国能源紧张的重要能源牧草之一。自然状态下的能源植物并 不是最理想的生产物种，虽然通过引进良种与当地植物杂交后筛选培育能够培育一些品 种，但这些技术手段已不能满足当今社会对能源植物的需求。随着转基因技术的不断进 步，利用转基因技术培育高产、优质、高效新型能源植物新品种也取得了相应的成果。 转基因技术在玉米、大豆和棉花等主要农作物上都得到了较好的应用。通过转基因技术 能够提高植物的生物量、降低植物中木质纤维素的含量、培育抗性品种等。转基因技术 的成功依赖于一个良好的转化系统，能有效地将外源基因导入受体细胞，并得以表达。 目前，关于能源植物芦竹的转基因技术还尚未报道，但其他能源牧草植物，如柳枝蓟、 芒等均在基因改良方面均有研究，故加快芦竹的转基因技术，势不可挡。在外源基因的 介导转化过程中，农杆菌转化法在单子叶植物中应用最为广泛，其主要优点有：培育周 期短、技术成熟、能够转化较大的外源基因片段，外源基因重排少，且以单拷贝或低拷 贝插入受体细胞，稳定性好等。在目前关于芦竹的遗传转化体系还未曾报道，但关于其 同属的植物有相关报道，以芦竹属的菌草绿洲3号的愈伤组织为受体材料，通过预培养 三天，于农杆菌OD600值为0.1侵染10min，共培养基中添加300μmol·L－1AS的 条件下，共培养1d的GuS表达率最高为1.5％,初步建立了农杆菌介导的绿洲3号愈伤组 织转化体系，但其转化效率低，且也没有得到转基因植株。故建立一种稳定、高效的芦 竹遗传转化体系，是研究芦竹抗性遗传机理的重要的方法手段。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植 体遗传转化方法，以用于芦竹转基因的研究。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，其包括如下步骤：

(1)外植体芦竹花穗的处理：将芦竹花穗用无菌水冲洗，再用含水乙醇浸泡，用无菌水冲洗后再用氯化汞(又称升汞)溶液浸泡，用无菌水冲洗，将花穗放置于接种盘中， 待其水分晾干，将花穗放置于愈伤组织诱导培养基中，培养得到初代愈伤组织；

(2)愈伤组织的增殖：将步骤1中得到的初代愈伤组织转入到愈伤组织增殖培养基中，培养获得具有同质性的愈伤组织；

(3)农杆菌的培养：将含有携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌，放入LB培养液中，培养，待OD600至0.6～0.8时，降温，离心，弃上清液，得到农杆菌悬 浮液，将所述农杆菌悬浮液与重悬液混合，配制成农杆菌侵染液，培养,得农杆菌侵染 液；所述重悬液培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；

(4)侵染与共培养：将步骤2获得的愈伤组织放入步骤3得到的农杆菌侵染液中，培养后将侵染液倒掉，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置后，放入共培养培养基中， 培养，得共培养好的愈伤组织；所述共培养培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；

(5)筛选培养：将步骤4中共培养好的愈伤组织放在筛选培养基上，进行抗性愈伤组织的筛选，得到抗性愈伤组织；