[发明专利]一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法

权利要求书

1.一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，其包括如下步骤：

(1)外植体芦竹花穗的处理：将芦竹花穗依次用无菌水冲洗，含水乙醇浸泡，无菌水冲洗，氯化汞溶液浸泡，用无菌水冲洗后，将花穗放置于接种盘中，待其水分晾干，将花穗放置于愈伤组织诱导培养基中，培养得到初代愈伤组织；

(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)中得到的初代愈伤组织转入到愈伤组织增殖培养基中，培养获得具有同质性的愈伤组织；

(3)农杆菌的培养：将含有携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌，放入LB培养液中，培养，待OD600至0.6～0.8时，降温，离心，弃上清液，得到农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与重悬液混合，配制成农杆菌侵染液，培养,得农杆菌侵染液；所述重悬液培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；

(4)侵染与共培养：将步骤(2)获得的愈伤组织放入步骤(3)得到的农杆菌侵染液中，培养后将侵染液倒掉，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置后，放入共培养培养基中，培养，得共培养好的愈伤组织；所述共培养培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；

(5)筛选培养：将步骤(4)中共培养好的愈伤组织放在筛选培养基上，进行抗性愈伤组织的筛选，得到抗性愈伤组织；

(6)分化培养：将步骤(5)中得到的抗性愈伤组织放到分化培养基上，进行分化培养得抗性芽；

(7)生根培养：将步骤(6)中得到的抗性芽放到生根培养基上，进行生根成苗，最终得到芦竹转基因植株。

2.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述步骤(1)无菌水冲洗10-60s，优选30s；所述含水乙醇为50-95％乙醇；所述氯化汞溶液浓度为0.05-0.2％。

3.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(1)中芦竹愈伤组织诱导的培养基成分包括：MS基本培养基、2，4-D 1-3mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5-6.5；优选，培养基成分包括MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；所述培养条件为20-30℃下暗培养20-30天；优选，25℃下暗培养24天。

4.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(2)中芦竹愈伤组织增殖的培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4-6.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH5.0-6.5；优选培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；所述培养条件为20-28℃下暗培养28-35天，每4周更新一次培养基；优选，25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。

5.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述步骤(3)中LB培养液包含：5-15g/L蛋白胨、4-6g/L酵母、5-15g/L氯化钠、80-120mg/L卡那霉素；农杆菌菌液150-250μl；优选，LB培养液包含：10g/L蛋白胨、5g/L酵母、10g/L氯化钠、100mg/L卡那霉素；农杆菌菌液200μl，培养条件为20-28℃、200-400rmp下震荡12-14h；优选，25℃，280rmp下震荡12-14h；所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、乙酰丁香酮150-250μmol/L，优选所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、蔗糖30.0g/L、乙酰丁香酮200μmol/L；培养条件为20-28℃、200-400rmp下震荡1-3h；优选25℃，280rmp下震荡2h。