[发明专利]一种能降解玉米赤霉烯酮的水解酶的突变体构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种能降解玉米赤霉烯酮的水解酶的突变体构建方法及其应用，属于生物技术和基因工程技术。本发明提供的玉米赤霉烯酮水解酶突变体相对于未突变的水解酶具有相似或较高的催化活性，对于玉米赤霉烯酮的降解率显著提高。本发明将获得的玉米赤霉烯酮水解酶突变体在食品级酵母菌乳酸克鲁维酵母中实现了酶的分泌表达，表达产物具有食品级安全性，适合在食品和饲料等行业中应用。

技术领域

本发明涉及一种能降解玉米赤霉烯酮的水解酶的突变体构建方法及其应用，属于生物技术和基因工程技术。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone)是由镰刀菌属产生的一种雌激素二羟基苯甲酸内酯，最早发现于发霉的玉米中，是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，在发霉玉米、小麦等谷物及其制品中广泛存在。玉米赤霉烯酮的雌激素毒性可引起猪等家畜的生殖障碍，给饲养业造成巨大损失；玉米赤霉烯酮可通过食物链在人体内蓄积，会增大患乳腺癌、肝癌、食道癌等的发病率，对人类健康造成巨大的威胁。

目前，主要采取物理、化学和生物脱毒的方法降低发霉玉米、小麦等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的毒性。以饲料行业为例，物理法包括高温破坏、紫外线、射线照射和吸附等，缺点是会导致饲料中营养物质的损失和破坏、吸附剂的二次污染及吸附剂成本较高、毒素处理不完全等；化方法包括臭氧解毒，过氧化氢等强氧化剂处理，酸、碱处理，碳酸钠浸泡处理。该方法会改变饲料的营养成分、适口性并对食品安全造成新的危害，不适宜用于大批量处理被玉米赤霉烯酮污染的饲料；生物学方法的原理涉及微生物细胞吸附，微生物本身或其酶降解玉米赤霉烯酮产生无毒产品，因此该方法可有效替代物理化学法用于饲料中玉米赤霉烯酮的去除，这些生物学方法需要安全有效的菌株来吸附或降解玉米赤霉烯酮。微生物降解酶/水解酶被认为是玉米赤霉烯酮解毒的最佳方法，因为酶法处理可以不破坏饲料营养成分，是一种绿色安全的处理方法。

目前已经报道了多种微生物具有降解玉米赤霉烯酮的能力，2002年，Takahashi等从一株粉红粘帚霉菌(Clonostachys rosea)中得到一种内脂水解酶ZHD101，能特异性地结合降解玉米赤霉烯酮，ZHD101切割玉米赤霉烯酮大环上的内酯键产生具有开放侧链的二羟基苯基衍生物，随后丢失二氧化碳得到一种无毒的烷基间苯二酚产物。后来又有研究者通过定点突变ZHD101的相关氨基酸残基(V153H/V158F)获得了降解效果更好的玉米赤霉烯酮水解酶突变体，并命名为ZHD101.1。但是该突变体酶的表达是在大肠杆菌中实现的，由于大肠杆菌为一种条件致病菌，因而通过该技术实现的产品并不适合应用在食品、饲料等行业。

发明内容

为提高水解酶对玉米赤霉烯酮的降解率，本发明通过分析水解酶ZHD101.1结构上的潜在突变热点(即有突变改造价值的氨基酸残基位点)，应用分子生物学技术构建定点突变，并筛选出降解率提高的突变体，进一步推进该玉米赤霉烯酮水解酶的优化改造，为工业化生产和应用奠定基础。

本发明提供了对玉米赤霉烯酮降解率提高的玉米赤霉烯酮水解酶的突变体，具有如下至少一个位点的突变：

S103A、V172R、G205Q或H248E。

在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸。

在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第172位缬氨酸突变为精氨酸。

在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第205位甘氨酸突变为谷氨酰胺。

在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第248位组氨酸突变为谷氨酸。