[发明专利]一种外周血含有CIK细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种外周血含有CI K细胞的培养方法，属于生物技术领域，且该种外周血含有CI K细胞的培养方法包括以下步骤：步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养；步骤2、CI K细胞的培养。且本发明在CI K细胞的培养过程中添加了CD28单克隆抗体，利用CD28可以增加T细胞的活化，促进T细胞I L‑2生成和抗原特异性的多克隆T细胞的增殖，能明显增加CI K细胞的增殖倍数，提高了CI K细胞繁殖能力；还添加了I L‑1α、I L‑15和I L‑21刺激因子，诱导培养的C I K细胞中穿孔蛋白、颗粒酶B和CD107a表达，提高了CI K细胞的细胞毒活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种外周血含有CIK细胞的培养方法。

背景技术

CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

目前，CIK细胞的常用活化方法是将分离得到的外周血单个核细胞采用CD28单克隆抗体、白细胞介素-1(IL-1α)，白细胞介素-2(IL-2)以及γ-干扰素(英文名称IFN-γ)等因子进行活化，进一步长期培养法采用静态和间歇换液的方式进行扩增，然而普遍存在激活效率低、培养周期长及因营养物耗竭或毒副产物积累而限制细胞生长的现象，细胞扩增效果难以满足临床需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外周血含有CIK细胞的培养方法，用以解决目前CIK细胞的培养方法培养出来的CIK细胞繁殖能力差、细胞毒活性低的技术问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种外周血含有CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：

步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集患者或志愿者的外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液一次离心分离出单个核细胞；用毛细血管吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤、二次离心，纯化，重复2-3次；再用培养基A悬浮并调整细胞密度为4×10⁶/L，并将此培养基A接种于30cm²的培养瓶中，然后培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中97-100％湿度培养24h后收集细胞，进行三次离心，弃上清，获得培养后的单个核细胞；

步骤2、CIK细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基B悬浮并调整细胞密度为1.8×10⁶/L，并将此活化培养基B接种于180cm²的已包被CD28抗体的培养瓶中，并置于37℃，5％CO₂培养箱中97-100％湿度培养，24小时后，依次加入IL-15和IL-21，继续培养，每1-2天半量换取扩增培养基C，维持细胞密度为1.8×10⁶/mL，培养至需要数量。

进一步地，步骤1中一次离心的离心条件为离心力为260xg，离心18min，温度为13-18℃，二次离心的离心条件为离心力为300xg，离心23min，温度为20-23℃，三次离心的离心条件为离心力为250xg，离心17min，温度为17-22℃。

进一步地，步骤1中培养基A为培养基干粉、L-谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C、ALK抑制剂、GSK-3抑制剂、胰岛素、人血浆白蛋白、碳酸氢胺混合形成，其中，L-谷氨酰胺的浓度为0.5-1.5g/L、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.2-0.6mg/L、维生素C的浓度为12-18mg/L、ALK抑制剂的浓度为1-5ug/L、GSK-3抑制剂的浓度为1-5ug/L、胰岛素的浓度为6-9mg/L、人血浆白蛋白的浓度为1-5g/L、碳酸氢铵的浓度为5-15g/L。