[发明专利]一种外周血含有CIK细胞的培养方法

权利要求书

1.一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液一次离心分离出单个核细胞；吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤、二次离心，纯化；再用培养基A悬浮并调整细胞密度为4×10⁶/L，并将此培养基A接种于培养瓶中培养24h后收集细胞，进行三次离心，弃上清，获得培养后的单个核细胞；

步骤2、CIK细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基B悬浮并调整细胞密度为1.8×10⁶/L，并将此活化培养基B接种于已包被CD28抗体的培养瓶中培养，24小时后，依次加入IL-15和IL-21，继续培养，每1-2天半量换取扩增培养基C，维持细胞密度为1.8×10⁶/mL，培养至需要数量。

2.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤1中一次离心的离心条件为离心力为260xg，离心18min，温度为13-18℃，二次离心的离心条件为离心力为300xg，离心23min，温度为20-23℃，三次离心的离心条件为离心力为250xg，离心17min，温度为17-22℃。

3.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤1中培养基A为培养基干粉、L-谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C、ALK抑制剂、GSK-3抑制剂、胰岛素、人血浆白蛋白、碳酸氢胺混合形成。

4.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤2中活化培养基B为向培养基A中加入IL-2、IL-1α和IFN-γ形成的，且IL-2的浓度为5×10⁴-1×10⁵U/L，IL-1α的浓度为5×10⁴-1×10⁵U/L，IFN-γ的浓度为2×10⁵-2×10⁶U/L。

5.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤2中已包被CD28抗体的培养瓶为用包被液包被于培养瓶底部，在14℃孵育70min形成的，其中，包被液为CD28单克隆抗体和IFN-γ溶于PBS缓冲溶液配制而成，且CD28的浓度为1×10⁵-1×10⁶U/L，IFN-γ的浓度为2×10⁵-2×10⁶U/L。

6.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤2中IL-15、IL-21加入后占培养液的浓度分别为16-19μg/L和7-9μg/L。

7.根据权利要求1所述的一种外周血含有CIK细胞的培养方法，其特征在于，步骤2中活化培养基C为向培养基A中加入IL-2形成的，且IL-2的浓度为2×10⁵-1×10⁶U/L。