[发明专利]一种苯丙烷代谢途径代谢物的液质联用分析方法及应用

说明书

本发明涉及生化代谢分析领域，具体而言就是依据苯丙（烯）酸类、香豆素类和黄酮类（统称为苯丙烷类）代谢物在体内合成过程中具有前后对应关系，因此其含量变化有相关性，通过定量检测这些代谢物含量变化，分析苯丙烷类化合物在有机体内的代谢趋势。本发明使用液相色谱‑电喷雾电离‑质谱联用技术建立了103个苯丙烷类（包括62个同分异构体）代谢物定性鉴定和定量分析方法，并在银杏、大豆等有机体中进行了分析应用。本发明的目的是通过建立灵敏度高、定性准确、操作简单的检测方法，分析苯丙烷类代谢途径的变化趋势，为研究生物代谢过程提供新思路新方法。

技术领域

本发明涉及生化代谢分析领域，具体而言就是利用苯丙素类与黄酮类代谢物因生物合成关系造成的结构相似性,通过定量检测有相同取代基结构的苯丙(烯)酸类、香豆素类与黄酮类代谢物含量变化确定苯丙烷类代谢途径的变化趋势，为研究生物代谢过程提供新思路新方法。

背景技术

苯丙素类(phenylpropanoids)是一类含有一个或几个C₆-C₃为基本单位的化合物，包括苯丙烯类、苯丙醇类、苯丙(烯)酸及其缩酯类、香豆素类、木脂素类、黄酮类、木质素等。这类化合物在植物生长调节及抗御病害侵袭等生命过程中发挥重要作用。香豆素(coumarin)最早从豆科植物香豆中分离得到，并具有芳香气味，故名香豆素。它由苯丙素类在生物体内衍生而来，从结构上看，它的母核是顺式邻羟基桂皮酸内酯化形成的。香豆素以游离或糖苷形式广泛分布于植物界，它们在植物体内起着植物激素的作用或作为植物收到外来侵害时的应激素。从广义上讲，黄酮类(flavonoids)化合物属于苯丙素类，因为其C₆-C₃-C₆骨架来源于苯丙素类的C₆-C₃骨架。它是植物中分布最广的一类次生代谢物，除了形成花色外，对调节其生长发育和抵御异物入侵也有重要作用。C₆-C₃-C₆骨架是黄酮类的基本母核，根据C₃部分的成环、氧化和取代方式的差异，可以分为二氢黄酮类(flavanones)、黄酮类(flavones)、二氢黄酮醇(flavanonols)、黄酮醇(flavonols)、异黄酮(isoflavones)、黄烷醇(flavanols)、花色素(anthocyans)以及双黄酮(biflavones)等，骨架上的甲基、羟基或甲氧基取代进一步丰富了黄酮物质的结构多样性。苯丙烷类代谢代谢途径存在于所有陆地生物中，因此研究其代谢过程具有重要的理论及应用价值。

目前已知苯丙烷类代谢物的生物合成过程来源于桂皮酸途径(cinnamic acidpathway)：由莽草酸形成的苯丙氨酸和酪氨酸，经脱氨、氧化等反应生成桂皮酸，再由桂皮酸经氧化、甲基化、还原等反应转化生成具有C₆-C₃骨架的苯丙素类和C₆-C₃-C₆骨架的黄酮类(图1)。因此黄酮类与苯丙烯酸、香豆素等苯丙素类在生物合成上具有密切关系，同位素示踪实验已经证明黄酮类分子中的A环中的C₆结构由三个乙酰-CoA分子头尾相接合成，B环和C环的C₆-C₃结构则来自桂皮酸途径形成的苯丙烯酸类。基于以上实验事实，具有相同羟基、甲氧基等取代基的苯丙烷类代谢物很可能来源于同一条合成途径，因此含量变化具有相关性。

本发明利用上述理论基础，特异检测具有相同取代基的不同类代谢物，通过比较含量差异监测特定条件下的苯丙烷类代谢途径代谢趋势，为代谢分析提供依据。由于苯丙烷类化合物结构相似，同分异构体多，造成目前常用的检测方法定性可靠度低，检测灵敏度较弱。本发明使用液相色谱-电喷雾电离-质谱联用技术进行代谢物的定性定量检测：利用特异子母离子配对及其它们的保留时间做参数对代谢物特别是结构性质相近的同分异构体进行准确定性鉴定，提高了检测的靶向性，克服了一般方法分析定性不精准的缺点；同时根据特异子离子的丰度对代谢物进行定量检测，极大提高了检测灵敏度，另外本方法无需同位素示踪来分析同一代谢途径的代谢趋势，操作简单，适用性广泛。

发明内容