[发明专利]骨桥蛋白的分离方法和分析方法

说明书

本发明提供了一种骨桥蛋白的分离方法和分析方法。该分离方法包括：采用强阴离子交换色谱柱对含骨桥蛋白的待测试物进行HPLC分离，得到骨桥蛋白样品，其中，强阴离子交换色谱柱中的填充材料包括与三甲基氨丙基键合的表面多孔型硅胶、或与三甲基氨丙基键合的微孔乙基乙烯基苯交联55％二乙烯基苯聚合物。本发明所使用的强阴离子交换色谱柱达到了OPN与其他杂质有效分离的目的。与现有技术中采用质谱分析骨桥蛋白肽段的分析方法相比，本申请中OPN的分离方法使得含OPN的待测试物中各成分在色谱柱上的保留差异明显，总体上对OPN的选择性优越、灵敏度高、具有更好地分离能力，从而能够对待测试物中的OPN进行更准确的分析。

技术领域

本发明涉及骨桥蛋白的分析技术领域，具体而言，涉及一种骨桥蛋白的分离方法和分析方法。

背景技术

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种酸性磷酸化糖蛋白，具有多种功能包括通过影响紧密连接来维持肠道的完整性，这有助于维持肠粘膜屏障、维持肠道结构、调节肠道炎症、细胞粘附、骨重塑、血管生长、草酸钙形成的调节和细胞信号传导等。OPN与人类免疫反应有关，其中，包括小鼠模型中的调理素活性并有助于炎症细胞迁移至伤口部位和细胞因子表达。Senger等人在母乳中鉴定出OPN，随后又在牛奶中鉴定出OPN，尽管其含量低于母乳。在母乳中，OPN约占蛋白质总量的100～300mg/L，平均为138mg/L。牛乳含有大约15～20mg/L的OPN(Schack等人，2009年；Lonnerdal，2011)，比人乳中OPN的含量低约5到10倍(Lonnerdal，2011)。另外，某些商用婴儿配方奶粉中(从韩国和丹麦获得)也含有5～13mg/L天然OPN，其含量远低于母乳。

母乳中含有低水平的多种不同蛋白质，而且这些蛋白质有助于母乳喂养的整体益处。与配方奶粉喂养的婴儿相比，母乳喂养的婴儿感染(如中耳炎、腹泻)的几率降低，胃肠道舒适度也会提高。在婴儿期的前六个月，母乳喂养优于配方奶粉喂养，随后随着添加辅食而继续母乳喂养，并根据母亲和婴儿的共同意愿，继续母乳喂养一年或更长时间。然而，当母乳喂养不足或不能作为一种可行的选择时，在营养价值方面最接近母乳的成分和功能的婴儿和后续配方奶粉的成分是有利的。

欧盟委员会(EC，2013)将婴儿配方食品定义为：“婴儿在出生后最初几个月内使用并在引入适当的辅食之前满足婴儿的营养需求的食品”。欧盟委员会也将婴儿配方奶粉定义为“在引入适当的辅食后供婴儿使用的食品，该食品构成此类婴儿逐渐多样化饮食中的主要液体成分”。目前，任何婴儿配方奶粉制造商的目标都是力求尽可能模仿母乳的成分和功能，为0～12个月大的婴儿提供营养丰富、促进生长的配方奶粉。在过去的几十年中，对婴儿营养需求的基础研究显著增加，这有助于婴儿配方奶粉提供更符合母乳的营养价值和生物成分。尤其在过去的20年里，对母乳成分的评估有了很大的提高，对婴儿生长发育可能很重要的新成分也得到表征，其中一些成分包括二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸和乳铁蛋白(Lonnerdal，2014；Richard等人，2016)。但是，其中对于骨桥蛋白的表征研究却远不如上述各成分的表征研究。

牛乳中的骨桥蛋白有两种形式；①全长OPN(262个氨基酸残基)，分子量为33.9kDa，包括修饰(在SDS-PAGE中迁移约60kDa)和②N端片段(氨基酸残基1-150)，分子量为19.8kDa，包括修饰(在SDS-PAGE中迁移为35～40kDa)。N端片段由乳腺和乳汁中的固有蛋白水解活性产生(Bissonnette等人，2012年；Christensen等人，2014年)，且Bissonnette、Christensen等人已经描述了母乳中OPN的类似裂解，发现牛和人OPN之间的裂解位点相似，另外，全长OPN和N端片段两种OPN的功能相同，片段和整蛋白能够被同时检测到。