[发明专利]一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD₆₀₀值；对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；再对重悬液离心，收集第二沉淀；采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；将所述感受态细胞冷冻保存。本发明使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达5*10^9cfu/μg DNA。保存半年转化效率都不会发生改变，质量稳定，使用方便，可以极大程度降低科研人员的实验成本，提高研究效率。

技术领域

本发明涉及生命科学和基础医学科研领域，特别是涉及一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法。

背景技术

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl₂， RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂和RbCl(KCl)法，虽然RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl₂法简便易行，且其转化效率已可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-80℃下保存，能保存半年，因此CaCl₂法使用更广泛。

但是在CaCl₂制备方法中，感受态细胞产品的转化效率还存在着巨大的进步空间，距离国际水平存在明显差距，尤其从转化效率上看，使用pUC19质粒DNA 检测，目前我国市场上的感受态细胞产品转化效率多数不足10^8cfu/μg DNA，仍需要不断进步。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，其优点是能快速制备，转化效率更高，更加稳定，广泛适用于基础科研领域，提高科研人员实验效率。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种获得大肠杆菌超级感受态细胞的制备方法，包括步骤为：

步骤1：接种受体菌，在LB固体培养基上划线，获取单克隆；

步骤2：将单克隆至培养基中，摇床上振荡培养；

步骤3：当振荡培养浑浊后，测定溶液的OD₆₀₀值；

步骤4：对溶液冷却、离心，收集第一沉淀；

步骤5：采用缓冲液将所述第一沉淀重悬得到重悬液，并冷却；

步骤6：再对重悬液离心，收集第二沉淀；

步骤7：采用缓冲液将所述第二沉淀重悬；

步骤8：滴加二甲基亚砜，冷却，得到感受态细胞；