[发明专利]滚环扩增诱导酶开关激活的方法

说明书

本发明涉及一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法。该方法以被二价铜离子(Cu²⁺)抑制了催化活性的辣根过氧化物酶(HRP)为酶开关(HRP‑Cu²⁺)，以核酸滚环扩增中产生的焦磷酸根离子(PPi)为激活剂。当引物DNA和模板DNA、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、核酸连接酶SplintR及聚合酶phi29共存时，引发核酸滚环扩增反应，由于每个dNTP生成碱基的反应会产生一个PPi，所以伴随滚环扩增过程会有大量的PPi生成。基于PPi对Cu²⁺强的络合作用，HRP‑Cu²⁺中的Cu²⁺被PPi络合离去，从而恢复HRP的活性，完成酶开关的激活。该滚环扩增诱导酶开关激活的方法可联合HRP催化反应，能对可诱发滚环扩增反应的靶标分子进行比色、化学发光等检测，对高灵敏生物诊断方法的发展具有重要意义。

一、技术领域

本发明介绍了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法。该方法以被二价铜离子(Cu²⁺)抑制了催化活性的辣根过氧化物酶(HRP)为酶开关(HRP-Cu²⁺)，以核酸滚环扩增中产生的焦磷酸根离子(PPi)为激活剂，基于PPi对Cu²⁺强的络合作用来恢复HRP的活性，激活酶开关。

二、背景技术

生物酶是自然界中广泛存在的生物催化剂，它参与调节生物有机体的每一个生物过程。由于生物酶具有高底物特异性和高催化活性，在农业生产、工业制造、生物技术、化学、医学、环境等很多领域都得到了广泛的应用。在分析化学中，利用生物酶作为信标分子，通过生物酶对底物的酶促反应，实现信号的放大，基于此已经发展了多种高灵敏的电化学、化学发光、比色、荧光等分析方法。

HRP是目前研究最广泛的生物过氧化物酶，由于它的高稳定性和即时可用性，HRP经常用于蛋白质和核酸的检测。例如：在蛋白质检测中，用带有HRP的二抗识别蛋白质，然后加入无色底物四甲基联苯胺(TMB)或者2，2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，HRP可以催化TMB产生蓝色的产物或者催化ABTS产生绿色的产物，通过对这些有色产物进行肉眼观测或吸光度测定，实现对靶标蛋白质的定性及定量分析。由于基于HRP酶促反应的检测方法具有稳定性好、响应速度快、催化效率高、成本低等优点，已广泛应用于商品化的蛋白质试剂盒，如酶联免疫分析(ELISA)类试剂盒。然而在这些应用中HRP作为信标分子需要标记在二抗上，且都是异相分析方法，常需要洗涤、分离等步骤，其临床应用受到一定的限制。

Cu⁺是HRP的强抑制剂，当Cu⁺存在时，HRP的活性被抑制，从而不能催化底物进行显色反应，基于此现象，HRP被用于发展了一些均相检测方法。例如，由于Cu⁺可通过抗坏血酸还原Cu²⁺生成，所以基于HRP的抑制发展了均相检测Cu²⁺的比色方法；另外，PPi对Cu²⁺有强的络合作用，且抗坏血酸不能还原被PPi络合后的Cu²⁺，所以基于HRP的抑制又进一步发展了均相检测PPi及其水解酶如焦磷酸酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶等的方法。虽然这些方法实现了均相检测，然而其检测原理都是基于HRP的活性抑制，而HRP的活性受溶液环境影响较大，所以对检测对象及其样本环境要求高。

本发明基于PPi对Cu²⁺的络合强于HRP对Cu²⁺络合，结合PPi的滚环扩增式生成，设计了一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，该方法可联合HRP催化反应，构建高灵敏的比色、化学发光等分析方法，用于能诱发滚环扩增反应的靶标分子的检测。该方法简单、快捷、灵敏、通用，在生物分析领域有较大的应用前景。

三、发明内容

本发明的内容是：制备酶开关，结合核酸滚环扩增反应，利用PPi对Cu²⁺强的络合作用，发展一种滚环扩增诱导酶开关激活的方法，并联合HRP催化反应，应用于能诱发滚环扩增反应的靶标分子的高灵敏检测。