[发明专利]一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用，首先得到串联两个sgRNA表达框的中间载体；然后得到pBI121‑MCS‑Cas9；再设计包含两条sgRNA的引物，以所述中间载体为模板进行PCR；最后通过同源重组把PCR产物连入pBI121‑MCS‑Cas9中。通过上述制备方法可制备得到所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体，以pBI121载体为骨架载体，依次连接有sgRNA表达框1、sgRNA表达框2和Cas9表达框。本发明的方法提高了双靶点CRISPR/Cas9载体构建的效率，获得所述中间载体和所述pBI121‑MCS‑Cas9载体后，仅需设计一对引物进行一步PCR和一步同源重组即可成功构建双靶点CRISPR/Cas9载体，方便快捷。另外，本发明一次反应仅需20元，只需合成带接头的一对引物，不需额外的引物及其他试剂，显著降低了成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

CRISPR/Cas9已经成为目前最常用的基因编辑系统，CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸内切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA(transactivatingcrRNA)和crRNA(CRISPR RNA)融合而来。

sgRNA的5’端包括20nt的protospacer序列，该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割；其3’端则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffoldsequence)，该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex,RNP)。

目前植物中双靶点CRISPR/Cas9载体构建的方法主要有以下几种：

(1)酶切连接-同源重组联用

以白菜中双靶点CRISPR/Cas9载体构建流程为例，如图1所示，通常先设计带接头的sgRNA31和sgRNA32，分别退火生成双链；再用Bbs I酶切sgRNA表达框，通过T4 DNA连接酶把sgRNA31和sgRNA32连入其表达框(psgR-Cas9-At)；然后设计新的引物克隆sgRNA32表达框，用同源重组的方法把两个sgRNA表达框串联起来；再用Hind III和EcoR I酶切中间载体psgR-Cas9-At和目标载体pBI121，最后通过T4 DNA连接酶把两条sgRNA和Cas9表达框连入目标载体，从而成功获得目标重组分子。

(2)Golden Gate组装法

该方法的酶切连接，可以在同一反应体系中进行，不需要分步骤进行。首先，利用限制性核酸内切酶将DNA的序列切割开来；同时，使用DNA连接酶，将DNA片段按既定的顺序连接起来，该DNA片段不含有酶切位点。此方法通过边切边连、重叠延伸PCR，制备出了sgRNA表达盒(2个两端带有酶切位点)，随后将sgRNA表达盒组装到CRISPR/Cas9载体上，从而使目标载体构建成功。

如图2所示，以PJG090为模板，在扩增中使用了含有用于Golden Gate克隆的接头(OJH307和OJH308)的引物。推荐的试剂如下：1μL PCR产物，50ng PJG112、1μL CutsmartBuffer(NEB)，0.4μL T4连接酶缓冲液(NEB)，5U Bsa I(NEB)，20U T4DNA连接酶(NEB)，并将ddH₂O补齐至10μL。将反应孵育20～25个循环(37℃2min，20℃5min)，然后分别在50℃和80℃孵育5min。随后，将1μL产物引入到Trans T1感受态细胞中。阳性克隆通过克隆PCR鉴定并测序。

(3)Gibson组装法