[发明专利]一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种植物双靶点CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：克隆sgRNA表达框，所述sgRNA表达框依次连接有启动子和sgRNA支架，通过同源重组的方法把所述sgRNA表达框插入psgR-Cas9-At骨架载体，所述psgR-Cas9-At骨架载体上依次连接有启动子、sgRNA支架、Cas9表达框，所述启动子为U6-26或U3，所述U6-26的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述U3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA支架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cas9表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，此步得到串联两个所述sgRNA表达框的中间载体；

S2：通过酶切连接的方法把所述sgRNA表达框和所述Cas9表达框插入pBI121骨架载体，得到pBI121-Cas9；

S3：把步骤S2产物中所述sgRNA表达框中的Bpi I酶切位点改造成多克隆位点，得到pBI121-MCS-Cas9，所述MCS为多克隆位点；

S4：根据靶基因的DNA序列，设计2条sgRNA序列，分别为sgRNA1和sgRNA2，根据酶切位点的侧翼序列在所述sgRNA序列上加上接头作为PCR引物，所述PCR引物以步骤S1获得的所述中间载体为模板进行PCR扩增；

S5：通过同源重组的方法把步骤S4的PCR产物连入步骤S3的所述pBI121-MCS-Cas9中，获得所述植物双靶点CRISPR/Cas9载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中克隆sgRNA表达框使用的2对引物为：

2*U6-26-HR-F1：ACGACGGCCAGTGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；

2*U6-26-HR-R1：CAAAAACTCCGAATGAAAAAAGCACCGACTCGGTG；

2*U6-26-HR-F2：CCGAGTCGGTGCTTTTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；

2*U6-26-HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG；

所述psgR-Cas9-At骨架载体使用Sma I进行单酶切线性化。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中分别用Hind III和EcoRI双酶切所述psgR-Cas9-At骨架载体和所述pBI121骨架载体，酶切产物分别电泳后切胶回收，再用T4 DNA连接酶连接，得到所述pBI121-Cas9。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中设计两对引物，以所述psgR-Cas9-At骨架载体为模板，分别克隆所述U6-26启动子和所述sgRNA支架；Hind III和Sma I双酶切所述pBI121-Cas9骨架载体，所述U6-26启动子和所述sgRNA支架以及双酶切后的pBI121-Cas9骨架载体同源重组，得到所述pBI121-MCS-Cas9；

步骤S3中使用的2对引物为：

Bpi-MCS-121HR-F1：CATGATTACGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTC；

Bpi-MCS-MR1：CTAAAACAAGCTTGTCGACCTCGAGCAATCACTACTTCGA

CTCTAGCTGTATATAA；

Bpi-MCS-MF2：GTGATTGCTCGAGGTCGACAAGCTTGTTTTAGAGCTAGAA

ATAGCAAGTTAAAATA；

Bpi-MCS-121HR-R2：CAATTTGTGAAATATAAAAAAGCACCGACTCGGTG。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中所述多克隆位点为XhoI-Sal I-Hind III。