[发明专利]一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用

说明书

本发明提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。所述反应体系包含BRAF V600E位点的特异性扩增引物和野生型、突变型探针，通过优化PCR扩增体系中引物探针的浓度比例，使得整个反应体系的灵敏度和稳定性大幅度提高。本发明适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸等等微量样本中检测灵敏度高，结果准确可靠，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用。

背景技术

BRAF基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在肿瘤患者中最常见的突变是第15号外显子上的V600E突变。BRAF V600E突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。研究表明，BRAF V600E突变预示Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌患者预后不良。NCCN指南推荐的Lynch综合征的检测策略中，推荐在DNA错配修复蛋白缺失的病例中进行BRAF基因突变检测。BRAF是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，BRAF V600E突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，期和Ⅱ期临床试验证明携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者对BRAF激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，BRAF基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。

有研究表明，肿瘤患者的血液、胸腹腔积液、脑脊液等体液中可以检测到的游离DNA含量远大于正常人，并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性。随着肿瘤分子生物学研究的进展，游离DNA的检测及其生物学指标的研究已为临床肿瘤早期诊断、预后判断及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特意、无创或微创的分子生物学检测手段。

本申请提供了一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，检测灵敏度高，特异性好，在相关癌症的诊疗应用中有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，所述体系通过优化检测条件及引物浓度，最终实现了对多种类型样本的高效、准确和灵敏的检测，尤其是在微量核酸的检测中具有较高的优势，适用于肿瘤组织、外周血、血浆等多种样本类型的检测，尤其在游离核酸样本的检测中具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAFV600E位点的特异性探针组成：

（1）所述特异性引物包括：

BRAF V600E正向引物：5’-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA-3’，

BRAF V600E反向引物：5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’；

（2）所述特异性探针包括：

BRAF V600E野生型探针：5’-CTAGCTACAGTGAAATC-3’，

BRAF V600E突变型探针：5’-TAGCTACAGAGAAATC-3’。

优选地，所述野生型探针5’端具有VIC荧光基团修饰，突变型探针5’端具有FAM荧光基团修饰。

优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸。

更加优选地，所述探针的3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。

优选地，所述反应体系由10*引物探针混合物、ddPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成。