[发明专利]一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系及其应用在审
申请号: | 202110770639.8 | 申请日: | 2021-07-07 |
公开(公告)号: | CN113337586A | 公开(公告)日: | 2021-09-03 |
发明(设计)人: | 徐梅波;王雨倩 | 申请(专利权)人: | 远辰生物科技(苏州)有限公司 |
主分类号: | C12Q1/6858 | 分类号: | C12Q1/6858;C12N15/11 |
代理公司: | 苏州吴韵知识产权代理事务所(普通合伙) 32364 | 代理人: | 王铭陆 |
地址: | 215000 江苏省苏州市工业园区金*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 braf v600e 数字 pcr 反应 体系 及其 应用 | ||
1.一种检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系,包含引物探针混合物,其特征在于,所述引物探针混合物由一对检测BRAF V600E位点的特异性引物和一对检测BRAF V600E位点的特异性探针组成:
(1)所述特异性引物的序列,其特征在于:
BRAF V600E正向引物:5’-GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA-3’,
BRAF V600E反向引物:5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACC-3’;
(2)所述特异性探针的序列,其特征在于:
BRAF V600E野生型探针:5’-CTAGCTACAGTGAAATC-3’,
BRAF V600E突变型探针:5’-TAGCTACAGAGAAATC-3’。
2.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系,其特征在于,所述野生型探针5’端具有VIC荧光基团修饰,突变型探针5’端具有FAM荧光基团修饰。
3.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系,其特征在于,所述野生型探针和突变型探针的3’末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸;优选地,所述探针的3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系,其特征在于,所述反应体系由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成。
5.根据权利要求4所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系,其特征在于,所述引物探针混合物的浓度分别为:
BRAF V600E正向引物浓度为5.5-8.0μmol/L;
BRAF V600E反向引物浓度为5.5-8.0μmol/L;
BRAF V600E野生型探针浓度为2.5-4.0μmol/L;
BRAF V600E突变型探针浓度为2.5-4.0μmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用,其特征在于,所述反应体系用于检测血浆游离DNA中 BRAF V600E位点突变。
7.根据权利要求6所述的检测BRAF V600E位点的数字PCR反应体系的应用,其特征在于,检测血浆游离DNA中 BRAF V600E位点突变方法包括如下步骤:
(1) 提取样本中的DNA;
(2) 采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、模板DNA和去离子水组成的反应体系配制扩增反应;
(3) 按照如下扩增条件进行反应:95℃热启动,10分钟;94℃变性,30秒;60-65℃退火,60秒;扩增40个循环;98℃酶失活,10分钟;4℃保温,反应结束;
(4) 通过数字PCR仪采集荧光信号,分析得到样本DNA中 BRAF V600E位点的突变情况,计算突变比例信息。
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