[发明专利]RNA中m5

说明书

本发明属于生物基因技术领域，公开了一种RNA中m⁵C和m⁶A双重分析逻辑光电化学传感方法，RNA中m⁵C和m⁶A双重分析的逻辑光电化学传感方法包括构建H型纳米支架；进行DNA步行器的构建；进行DNA折纸的构建；进行电极表面修饰和光电信号检测。本发明检测灵敏度高，具有临床实验室推广应用前景；不同浓度的m⁵C靶序列不影响m⁶A靶序列的光电信号；当不同浓度的m6A靶序列与10^‑7M m⁵C靶序列共同孵育后在同一根电极表面检测的625nm波长下的光电信号，不同浓度的m⁶A靶序列不影响m⁵C靶序列的光电信号，说明具有同时检测两种靶序列的能力。

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，尤其涉及一种RNA中m⁵C和m⁶A双重分析逻辑光电化学传感方法。

背景技术

目前，RNA甲基化是RNA转录后最主要的表观遗传修饰方式，RNA甲基化包括N6-甲基腺嘌呤m⁶A、N7-甲基鸟嘌呤m⁷G、5-甲基胞嘧啶m⁵C、N1-甲基腺嘌呤m1A、假尿嘧啶Um等五种类型，其中m⁶A和m⁵C是发生最高频的两类修饰，而m⁶A叠合m⁵C(即特定RNA序列中腺嘌呤A和胞嘧啶C均同时发生甲基化修饰)占RNA甲基化比率≧95％。mRNA和lncRNA等非编码小RNA通过甲基化修饰调控RNA的可变剪切、转录本组装和蛋白质翻译等；在肿瘤发生中，直接参与调节抑癌基因失活和癌基因表达。大量研究表明，m6A和m5C 修饰水平的偏倚与肿瘤、代谢性疾病、神经缺陷、心血管疾病和异常分化等密切相关。RNA甲基化分析已成为自身免疫性疾病、代谢性疾病等基因表观紊乱疾病临床诊断，和肿瘤早期预警与去甲基化治疗方案选择的新手段，RNA甲基化临床适宜检测技术研究具有重大意义。

依据检测原理不同，迄今已研究建立的RNA甲基化分析技术主要包括以下三类：

一是基于免疫共沉淀和全基因组测序建立的RNA甲基化测序分析 (MeRIP-seq)：MeRIP-seq分析是利用m⁶A和m⁵C特异性抗体筛选携带m⁶A 和m⁵C的mRNA片段并将其沉淀，构建相应的cDNA文库后进行高通量测序。该技术是目前唯一可实现甲基化定位和丰度分析以及甲基化碱基类别鉴定的 RNA甲基化检测技术。但由于该方法的分辨率仅约100个bp，测序长度受限，且易受跨越残基的大峰影响；另一方面，测试结果受测序深度的影响，文库构建过程复杂；同时，由于检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求，导致其难以在临床实验室推广应用。

二是基于高效液相色谱和质谱技术为基础建立的液相色谱-串联质谱技术：即LC-MS/MS，该技术可测定基因组RNA甲基化水平，能够对含痕量RNA的生物样本(如血浆)进行全RNA甲基化丰度的准确测定。但由于分析前需进行 RNA提取和多重洗脱，并需采用核酸外切酶将RNA水解为单核苷酸，因而存在检测过程繁冗、洗脱纯度干扰和酶解不完全等缺陷。

第三类是基于特定位点切割与夹板提取结合薄层色谱技术而构建的 SCARLET分析。SCARLET是一种整合了特定位点切割、放射性标记、夹板辅助提取以及薄层色谱等多种技术的RNA测序法。该类技术分辨率高，但由于涉及放射性污染，以及同样存在酶解效率和测序后庞大的数据处理等缺陷，而限制了其在临床医学实验室的开展。