[发明专利]一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于检测FLT3‑F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒，所述crDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测FLT3‑F691L突变的等温扩增引物，包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物；所述试剂盒含有所述crDNA或者所述的crRNA、以及Cas12a蛋白、荧光探针和所述等温扩增引物。本发明首次采用CRISPR荧光法检测FLT3基因F691L突变，具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL)、特异形的特点。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒。

背景技术

基因研究和诊断是实现精准医疗的关键，其中耐药突变的检测对于指导临床用药和判断预后具有重要意义。FLT3(fms-样酪氨酸激酶-3)基因是III型酪氨酸激酶受体家族成员，其突变与急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)的发生发展密切相关，约三分之一的AML患者具有FLT3基因突变。近几年FLT3抑制剂如Gilteritinib和Quizartinib的上市为AML患者带来了希望，然而耐药突变的产生会导致无效治疗。FLT3基因的F691L突变是导致FLT3抑制剂获得性耐药的最常见原因之一。

目前FLT3基因F691L突变的检测是通过常规PCR和测序技术实现。但现有的技术存在一些缺陷，如需要专业人员操作PCR仪、一代测序灵敏度不高、二代测序耗时长以及成本较高等，不适合用于床旁检测和推广到基层社区。

因此，有必要开发一种更高效、灵敏的基于CRISPR/Cas13系统的FLT3-F691L突变的检测试剂盒。

发明内容

本发明目的是提供一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA、等温扩增引物和试剂盒，特异性强，灵敏度高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述技术方案中，所述crRNA的制备方法为设计并直接合成crRNA，或者构建载体pUC57-T7-crRNA，用转录试剂盒进行体外转录获得crRNA。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物，所述等温扩增引物包括如SEQ ID NO.13所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物。

在本发明的第三方面，提供了所述的crRNA或/和所述的用于检测FLT3-F691L突变的等温扩增引物在制备用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒上的用途。

在本发明的第四方面，提供了一种用于检测FLT3-F691L突变的试剂盒，含有所述crDNA或者所述的crRNA、以及Cas12a蛋白和荧光探针。

进一步地，所述荧光探针为ssDNA-FQ reporter，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。

所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。

作为本发明实施例的一种实施方式，所述ssDNA-FQ reporter的5’端修饰有6-羧基荧光素(6-FAM)基团，3’端修饰有荧光淬灭剂(BHQ1)基团。标记产物如下：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA-FQ reporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。