[发明专利]L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种L‑苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。所述生产菌株是利用基因工程手段，在具有苏氨酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的CreC蛋白包含R77P突变位点。摇瓶发酵实验表明，大肠杆菌MHZ‑0221‑4的L‑苏氨酸产量高于对照菌株MHZ‑0215‑2，改造后的R77P突变菌株MHZ‑0221‑4摇瓶平均转化率20.6％，较出发菌提高4.39个百分点。由摇瓶结果可以得出，改造菌的苏氨酸生产能力明显优于出发菌MHZ‑0215‑2，由此可见，基因creC的R77P点突变可以明显提高苏氨酸的生产能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3：149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。2020年梅花集团申请的中国专利ZL201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中CreBC双组分系统是全局感应调节系统，与其他全局调节因子一样，CreBC影响着细菌生理学的许多不同方面。其中CreC对碳分解代谢和细胞内氧化还原状态有影响，并且在低氧条件下，还影响大肠杆菌的生长和发酵特性，因此被用于代谢工程生产代谢产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种CreC蛋白突变体，所述突变体包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突变。

本发明中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1。

第二方面，本发明提供编码所述CreC蛋白突变体的核酸分子(包含CGC→CCC突变)。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：

(1)用于L-苏氨酸发酵生产；

(2)用于提高L-苏氨酸发酵产量；

(3)用于构建产L-苏氨酸基因工程菌。