[发明专利]L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.CreC蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突变；

其中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1。

2.编码权利要求1所述CreC蛋白突变体的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：

(1)用于L-苏氨酸发酵生产；

(2)用于提高L-苏氨酸发酵产量；

(3)用于构建产L-苏氨酸基因工程菌。

5.L-苏氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有苏氨酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的CreC蛋白包含R77P突变位点；其中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1；

优选地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)菌种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为菌株MHZ-0215-2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、pTargetF-N20(creC R77P)质粒及Donor DNA的构建

A1：以pTargetF质粒为模板，用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(creC R77P)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；A2：以W3110基因组为模板，用creC-UF/creC-UR引物对，扩增出上游同源臂①；A3：以W3110基因组为模板，用creC-DF/creC-DR引物对扩增出下游同源臂②；A4：以①、②为模板，用creC-UF/creC-DR引物对，扩增出up-creC-down片段，也称Donor DNA；

B、感受态细胞制备及电转化

B1：将pCas质粒电转入MHZ-0215-2感受态细胞中，得到阳性转化子MHZ-0215-2(pCas)；B2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD₆₅₀为0.4后制备电转感受态细胞；B3：将pTargetF-N20(creC R77P)质粒电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

C、重组验证

C1：使用引物对creC-F/creC-R对上述单菌落进行菌落PCR扩增；C2：将扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

D、构建相关质粒丢失

D1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；D2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(creC R77P)质粒已丢失；D3：挑取pTargetF-N20(creC R77P)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；D4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到L-苏氨酸生产菌株MHZ-0221-4(creC R77P)；

上述方法所使用引物序列如下：

pTF-sgRNA-F：5′-AGTCGCCCGTTTCGCGCCAATATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3′

pTF-sgRNA-R：5′-ATATTGGCGCGAAACGGGCGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCT-3′

N20-F：5′-TCGCCCGTTTCGCGCCAATATG-3′

creC-UF：5′-AATGAACCCGCGGCGCAGATC-3′

creC-UR：5′-TAATGCCACCGATATTGGCGCGAAACGGGGGATGTTGTAGCTGATTAAACGCCTG-3′

creC-DF：5′-CAGGCGTTTAATCAGCTACAACATCCCCCGTTTCGCGCCAATATCGGTGGCATTA

creC-DR：5′-CAGCGCCTGCGCGAGTTTACG-3′

creC-F：5′-ACCTTACTGCGTCGGGTGAAG-3′

creC-R：5′-AATGCGTAAACATACTGCTC-3′。