[发明专利]用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法

说明书

本发明公开了用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法，属于生物医用材料领域，首先合成由Sortase A酶特异性底物短肽接枝的甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)共轭物(HAMA‑P)，该底物与一定浓度的Sortase A酶促交联，即可获得可注射的透明质酸单网络水凝胶。该方法具有原料易得、反应条件温和、反应时间短、等优点。然后制备了酶、光双交联的透明质酸‑明胶双网络水凝胶，酶促交联的透明质酸水凝胶作为第一网络快速成胶，紫外光交联的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)水凝胶作为第二增强网络。本发明所制备的双网络水凝胶为细胞粘附生长提供了适宜的支架和三维微环境，在可注射组织工程、3D打印和细胞三维培养等方面都有着良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法。

背景技术

水凝胶是被广泛用于支持组织再生、作为细胞或药物的输送载体，或用于细胞三维培养应用的基质材料。透明质酸水凝胶(HA)具有生物相容性良好、不易降解、溶胀比高以及结构高度类似于细胞外基质等特点，是很有发展潜力的细胞三维培养支架材料。

目前，HA水凝胶主要通过化学官能团修饰，加入交联剂交联形成具有特定形状、机械硬度和生物活性的水凝胶。例如，通过与硫酸二肼反应将-SH共价交联到HA骨架上，并通过聚乙二醇二丙烯酸酯交联，以构建生物相容性的HA水凝胶。然而，这些活性试剂很容易发生副反应(与细胞表面的蛋白质反应等)，同时反应特异性较差。酶促交联反应因其温和的反应条件和特异性反应引起研究者广泛的兴趣。广泛存在于细菌细胞膜中的半胱氨酸转肽酶A(Sortase A)以其优异的反应动力学和高度特异性已经被应用于酶诱导的成键反应。Sortase A可以催化其中一个短肽底物中的C端序列LPXTG和另外一个短肽底物中的N端寡甘氨酸序列(G_n)之间形成新的酰胺键。特别地，Sortase A的浓度越高，酶促交联反应速率越快，因此可作为注射水凝胶的潜在交联体系。

值得注意的是，单一的HA水凝胶由于差的细胞粘附性使得三维培养时细胞形态始终为球状，不能促进细胞铺展。

而GelMA由于与明胶类似的优异的细胞粘附性和细胞相容性，有利于细胞生长增殖，但是其最大缺点是降解速率较快。因此单网络的水凝胶难以同时兼顾细胞相容性、机械强度和长时间稳定培养的要求。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，提供用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，为细胞的粘附、铺展和增殖提供良好的三维仿生环境，同时改善了支架材料降解过快等问题；本发明还提供用于细胞三维培养的双网络水凝胶的应用方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法，双网络水凝胶由Sortase A酶交联的透明质酸水凝胶网络和光交联的明胶水凝胶网络两部分组成，其制备方法包括如下步骤：

(1)Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA-P)的制备

酶底物短肽P通过迈克尔加成反应，即利用半胱氨酸侧链上的-SH官能团，直接共轭到甲基丙烯酸化透明质酸HAMA的双键上；

(2)HAMA-P/GelMA经酶、光双交联制备透明质酸-明胶双网络水凝胶(HAMA-P-GelMA)

将酶促交联底物HAMA-P以及水溶性光引发剂溶于DPBS缓冲液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明胶GelMA溶解完全，混合均匀后加入Sortase A酶溶液并经紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA双网络水凝胶。

进一步地，所述的酶底物短肽P为P₁(GGGG)和P₂(LPETG)；酶促交联底物HAMA-P的组成为HAMA-P₁和HAMA-P₂。