[发明专利]用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法及应用方法

权利要求书

1.用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）Sortase A酶促交联底物甲基丙烯酸化透明质酸（HAMA-P）的制备

酶底物短肽P通过迈克尔加成反应，利用半胱氨酸侧链上的-SH官能团，直接共轭到甲基丙烯酸化透明质酸HAMA的双键上；

（2）HAMA-P/GelMA经酶、光双交联制备透明质酸-明胶双网络水凝胶（HAMA-P-GelMA）

将酶促交联底物HAMA-P以及水溶性光引发剂溶于DPBS或TEOA缓冲液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明胶GelMA溶解，混合均匀后加入Sortase A酶溶液并经紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA双网络水凝胶。

2.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的酶底物短肽P选自P₁和P₂；对应的，酶促交联底物HAMA-P的组成为HAMA-P₁和HAMA-P₂。

3.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的HAMA的反应浓度为3~10μM；加入的TEOA缓冲液的浓度为100~500mM，pH为8.0，体积占总体积比的1/3~1；酶底物短肽P与HAMA的摩尔比为1:1~1:2。

4.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的HAMA-P的纯化步骤为加入无水乙醇将反应产物析出沉淀、离心，再次溶解于超纯水中。

5.根据权利要求2所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的酶促交联底物HAMA-P中HAMA-P₁和HAMA-P₂是等质量浓度的，两者总质量体积浓度为0.25~1%；GelMA的质量体积浓度为5~10%。

6.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的Sortase A酶的交联浓度为2~100μM。

7.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的水溶性光引发剂为Iragure2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂LAP，对应的紫外光源波长分别为365nm和405nm；使用的质量体积浓度为0.05~1%；紫外光照射时间为10~120s。

8.权利要求1-7中任意一项所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶的制备方法制备得到的用于细胞三维培养的可注射双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用。

9.权利要求8所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用的方法，其特征在于，包括如下步骤：

配置含有0.5~1%质量体积浓度的HAMA-P、5~7.5%质量体积浓度的GelMA以及0.25~0.5%质量体积浓度的光引发剂的水凝胶预溶液，完全溶解后除菌；消化培养的贴壁细胞，计数并离心，加入水凝胶预溶液，吹打均匀，使得细胞密度为2000~10000/mL；

加入50~80μM Sortase A酶溶液后快速滴加到PDMS薄膜上，并用玻片覆盖，紫外光固化，用DPBS淋洗负载细胞的水凝胶若干次，加入DMEM培养液浸没培养。

10.权利要求9所述的用于细胞三维培养的双网络水凝胶在体外细胞三维培养中的应用的方法，其特征在于，所述的除菌是用0.22μm滤膜过滤，所述的紫外光固化时间为10-30s。