[发明专利]一种用于塔格糖生产的固定化细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种生产塔格糖的固定化细胞制备方法及其用于生产塔格糖的方法。其中本发明的固定化枯草芽孢杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达75%，连续催化65批次后，产物得率仍可维持61%。固定大肠杆菌连续催化反应时，初始产物得率最高可达74%，连续催化65批次后，产物得率仍可维持60%。本发明简化了塔格糖生产中所需酶的分离纯化步骤，提高酶回收利用率，实现了酶的循环使用。本发明的方法具有易于产品分离，生产工艺简单，成本低廉等优点。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及塔格糖的生产制备领域。

背景技术

塔格糖是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。塔格糖的甜味特性与蔗糖相似，提供非常新鲜和纯净的甜度，但热量只有蔗糖的三分之一，被称为低热量甜味剂。研究表明塔格糖具有低热量、低升糖指数、抗龋齿、抗氧化、益生元、改善肠道功能、免疫调节、药物前体等重要生理功能特性，可以广泛应用于食品、饮料、医药、保健等领域，具有巨大的经济价值 (Oh D-K: Tagatose: properties, applications,and biotechnological processes. App. Microbiol. Biotechnol. 2007, 76:1-8)。

中国科学院天津工业生物技术研究所以廉价玉米淀粉、麦芽糊精、蔗糖等为原料，成功建立了塔格糖体外多酶合成新路线，从根本上改变了现有塔格糖的生产工艺（CN106399427A）。该多酶合成新路径不仅打破了化学法合成塔格糖能耗高，产物复杂，纯化困难，副反应多，化学污染大的限制；而且突破了生物法合成塔格糖的原料昂贵受限，转化率低，分离工艺复杂的缺陷。在此基础上，中国科学院天津工业生物技术研究所以廉价玉米淀粉、纤维素、麦芽糊精、蔗糖等为原料，利用全细胞催化制备塔格糖的方法（CN107988286A），该工艺减少了多酶纯化工艺步骤，降低了生产成本低和环境污染，提高了塔格糖产率。中国科学院天津工业生物技术研究所进一步针对食品制剂的安全生产问题进行改进，提供了一种利用枯草芽孢杆菌全细胞催化高浓度淀粉制备生产高浓度塔格糖的方法（CN112342179B）。该方法将透性化处理的枯草芽孢杆菌进行固定化，获得固定化全细胞，然后用于塔格糖的生产，实现了全细胞的循环使用，降低生产成本。但是经过研究分析表明该方法在制备固定化细胞时仍然存在一些不足：一是该方法在进行固定化前需要经过菌体收集，菌体重悬以及菌体透性化处理等多个繁琐步骤。二是该方法在透性细胞的基础上进行制粒固定化，而细胞透性化处理易造成胞内表达的异源蛋白的泄漏，进而在固定化进程中导致异源蛋白的损失以及酶固定化效率的降低。三是该方法只是通过简单挤压制粒的方式得到固定化酶颗粒，获得的固定化酶颗粒并非均一的。

因此，亟需在此基础上开发一种可简便获得均匀的固定化细胞的方法，既能简化酶的生产工序；又能避免或降低透性细胞在固定化过程中造成的酶的泄漏和损失，提高酶的固定化效率，实现酶的循环利用，再进一步降低塔格糖的生产成本，实现塔格糖的工业化生产。

发明内容

针对现有的固定化细胞制备塔格糖的方法所存在的问题如酶的生产步骤繁琐、透性化处理造成酶的损失及固定化效率降低、制备得到的固定化酶颗粒度不均匀等问题，本发明的目的在于提供一种固定化细胞生产塔格糖的方法，简化塔格糖生产过程中酶的生产步骤，简便塔格糖生产过程中产品和酶的分离纯化，实现多酶的循环使用，降低塔格糖的生产成本，实现塔格糖的工业化生产。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种用于塔格糖生产的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

通过发酵分别获得表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液，将上述发酵液混合得到发醇混合液；

向所述发酵混合液中加入1-10% w/v无机土，搅拌均匀；