[发明专利]一种用于塔格糖生产的固定化细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种用于塔格糖生产的固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

通过发酵分别获得表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液，将上述发酵液进行混合得发酵混合液；其中，分别表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、塔格糖6-磷酸异构酶和塔格糖6-磷酸磷酸酶的湿菌体的按OD600的比例为（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）：（0.1-10）进行混合；

向所述发酵混合液中加入1-10% w/v无机土，搅拌均匀；

再向所述发酵混合液中加入0.1-2% w/v絮凝剂絮凝菌体，随后加入0.05-3% v/v交联剂交联1-4 h；

真空过滤后得到滤饼，滤饼用旋转造粒机挤压制粒成长条状，然后经过球形抛丸机截断成长短均匀的颗粒；

获得的颗粒经沸腾干燥后得到用于塔格糖生产的固定化细胞，其中所述沸腾干燥的进风口温度控制在60-90℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶分别是耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热塔格糖6-磷酸异构酶和耐热塔格糖6-磷酸磷酸酶。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述耐热是指在40℃以上具有酶的活性。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，分别表达耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热塔格糖6-磷酸异构酶和耐热塔格糖6-磷酸磷酸酶的湿菌体的按OD600的比例为（1-10）：（1-10）：（1-10）：（1-10）：（1-10）进行混合，且混合后的菌悬液OD600在10-150之间。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机土选自蒙脱土、硅藻土、高岭土或膨润土。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚丙烯酰胺。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为聚乙烯亚胺或PDADMAC，且所述聚乙烯亚胺的分子量为600-70000。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自戊二醛、三羟甲基磷、N,N-亚甲基双丙烯酰胺或环氧氯丙烷。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括将获得的固定化细胞经过筛分得到形态均匀的固定化细胞的步骤。

10.一种固定化细胞生产塔格糖的方法，其特征在于：利用如权利要求1至9任一项所述方法得到的固定化细胞将淀粉或淀粉衍生物转化为塔格糖。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步地，反应结束后还包括过滤回收固定化细胞的步骤。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，其中生物转化反应体系中包含淀粉或淀粉衍生物50-300 g/L，pH值为5.0-8.0的缓冲液，10-50 mM无机磷酸根，3-7 mM二价镁离子和固定化细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述无机磷酸根可为磷酸钠或磷酸钾。