[发明专利]一种植物组织内生菌总DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种植物组织内生菌总DNA的提取方法，包括下列步骤：1)预处理液制备，预处理液pH＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；得到植物组织内生菌总DNA；本发明提高提取效率，提高了提取的成功率，降低了试验成本，简化了操作步骤。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种植物组织内生菌总DNA的提取方法。

背景技术

植物个体无论是一粒种子还是参天大树，都是一种相对复杂的生态环境，种类和丰度不同的微生物栖息其中。植物共生菌在植物界广泛分布,种类繁多。一方面,共生菌可能从宿主体内获取营养并通过宿主传播；另一方面,又对宿主植物有促进生长、抵御病虫害、抗逆、固氮等多方面的生物学作用。发挥这些作用的物质基础是伴生菌丰富多样的次生代谢产物,这些生物活性物质在农业、医药等领域具有一定的应用前景。

然而在进行植物内生细菌的研究过程中，内生细菌的分离鉴定一般比较困难。集合16S rDNA特异片段PCR扩增与第二代高通量测序技术进行植物内生细菌的鉴定是近年来比较流行的一种方法，但是提取的总DNA中含有大量的宿主DNA，包括大量的线粒体DNA与叶绿体DNA等，给细菌16S rDNA的扩增子的制备造成了极大的干扰。

而使用传统的植物组织或细菌提取方法进行提取的基因组DNA，存在大量的宿主基因组，会严重干扰内生细菌的扩增以及测序数据质量。使用等渗溶液对叶绿体以及线粒体进行分布去除，操作相对来说比较繁琐，并不适合大批量取。

发明内容

本发明提供了一种植物组织内生菌总DNA的提取方法，以解决现有技术的上述问题。

本发明的方案是：

一种植物组织内生菌总DNA的提取方法，包括下列步骤：

1)预处理液制备，预处理液pH＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；

2)往1.5ml RNase-free离心管中加入步骤1)中400μl～1ml的预处理液；然后往离心管中加入终浓度为1～10％的巯基乙醇，混匀；

3)取80～110mg的植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至所述离心管中，震荡混匀；10000～12000r/min，冷冻离心3～5min；

4)弃上清液，往所述离心管内加入500～800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ulRNA酶，混匀，37℃孵育30min；

6)往所述离心管中加入20ul蛋白酶K，加入25ul SDS溶液，混匀，56℃孵育20min；

7)往所述离心管中加入等体积的有机溶剂，上下颠倒混匀；

8)10000～12000r/min,室温离心5min；

9)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；

10)10000～12000r/min,室温离心5min；

11)取上清液，往上清液中加入醋酸钠与无水乙醇，混匀，-20℃孵育30min；

12)10000～12000r/min,室温离心10min；

13)弃上清液，重复清洗一次；

14)控干乙醇，加入50ul DNase-free水，得到植物组织内生菌总DNA。