[发明专利]一种植物组织内生菌总DNA的提取方法

权利要求书

1.一种植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于，包括下列步骤；

1)预处理液制备，预处理液pH＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；

2)往离心管中加入步骤1)中400μl～1ml的预处理液；然后往离心管中加入终浓度为1～10％的巯基乙醇，混匀；

3)取80～110mg的植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至所述离心管中，震荡混匀；10000～12000r/min，冷冻离心3～5min；

4)弃上清液，往所述离心管内加入500～800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul RNA酶，混匀，37℃孵育30min；

6)往所述离心管中加入20ul蛋白酶K，加入25ul SDS溶液，混匀，56℃孵育20min；

7)往所述离心管中加入等体积的有机溶剂，上下颠倒混匀；

8)10000～12000r/min,室温离心5min；

9)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；

10)10000～12000r/min,室温离心5min；

11)取上清液，往上清液中加入醋酸钠与无水乙醇，混匀，-20℃孵育30min；

12)10000～12000r/min,室温离心10min；

13)弃上清液，重复清洗一次；

14)控干乙醇，加入50ul DNase-free水，得到植物组织内生菌总DNA。

2.如权利要求1所述植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中100ml预处理液包含50mmol/L三羟甲基氨基甲烷，100mmol/L乙二胺四乙酸，10mmol/L氯化钠，体积分数为0.2～1％的聚乙二醇辛基苯基醚与2～4％质量浓度的聚乙烯吡咯烷酮。

3.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：

所述步骤5)中所述裂解液包括50～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷、1～2％质量浓度的十六烷基三甲基溴化铵、1～2mmol/L氯化钠、20～100mmol/L乙二胺四乙酸，所述裂解液pH7-8。

4.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：

所述步骤5)中所述溶菌酶溶液包括50～100mg/ml溶菌酶、20mmol/L三羟甲基氨基、2mmol/L乙二胺四乙酸与体积分数为1.2％的聚乙二醇辛基苯基醚。

5.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：

所述步骤6)中蛋白酶K的浓度为20mg/ml，SDS溶液的浓度为10％质量浓度。

6.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤11)中醋酸钠的浓度为3～3.5mol/L，醋酸钠的pH为5.2。

7.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中取100mg的植物材料于液氮中研磨成粉末。

8.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤7)中有机溶剂包括酚、氯仿与异戊醇，所述酚、氯仿与异戊醇的配制比例为24:25:1。

9.如权利要求1所述的植物组织内生菌总DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤11)中加入的醋酸钠体积为该步骤中上清液体积的三分之一，加入的无水乙醇体积为该步骤中上清液体积的两倍。