[发明专利]一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选模型

说明书

本发明涉及一种筛选新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)小分子抑制剂的方法及筛选模型。该方法及筛选模型基于荧光偏振(fluorescence polarization)原理，以荧光探针FITC‑Substrate‑Biotin作为新冠病毒Mpro的水解底物，再以亲和素(avidin)终止其水解反应，以多功能酶标仪检测实验体系的毫偏值(millipolarization units,mP)。活性化合物在本筛选模型中表现较高的mP值，非活性化合物则表现较低的mP值。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选 模型。

背景技术

快速研制新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗、人源化抗 体和抗新冠病毒药物已成为科学界面临的重大科学问题。尽管在研制新冠病毒疫苗方面取得了显著进展， 但对于未接种疫苗的个体或病毒高频基因突变导致疫苗保护力下降等情况，安全有效的广谱抗新冠病毒药 物也是至关重要的(WangZ,et al.Nature,2021)。虽然一些候选抗病毒药物已被用于临床治疗，如瑞德西 韦、法匹拉韦、利巴韦林、替比夫定等，但在大规模临床试验中均显示疗效有限或无效，积极开发新型广 谱抗新冠病毒药物具有重要意义。

目前研究表明，进化高度保守的新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)在调控新冠病毒RNA复制 中具有重要的生物学功能，且人体缺乏与其同源的蛋白酶，已成为新型广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶 标之一(Morse JS,et al.Chembiochem,2020；Jin Z,et al.Nature,2020；Jin Z,et al.Biochem Biophys Res Commun,2021)。在高选择性新冠病毒Mpro小分子抑制剂的开发过程中，简便、快速、灵敏、经济的药 物高通量筛选模型的建立是其高效筛选与开发的重要基础和关键技术(戚海燕,等.生命的化学,2021)。 目前已报道的Mpro小分子抑制剂筛选方法主要包括虚拟筛选法、荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer,FRET)、荧光素酶报告基因筛选法、绿色荧光蛋白剪切互补法和表型筛选法等(Li Z,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2020；Zhu W,etal.ACS Pharmacol Transl Sci,2020；Coelho C,et al.PLoS One,2020；Hung HC,etal.Antimicrob Agents Chemother,2020；马玲,等.药学学报,2020；Rawson J,et al.Viruses,2021；Froggatt HM,et al.J Virol,2020；Rothan HA,et al.Mol Biotechnol,2021；Riva L,et al.Nature, 2020)。但上述筛选方法普遍存在假阳性率高、筛选成本高、操作繁琐、稳定性差、筛选周期长等缺点， 较大地限制了其在大规模高通量筛选中的应用(戚海燕,等.生命的化学,2021)。因此，积极开发简便、 快速、灵敏、经济的新型Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型具有重要意义。

发明内容

本发明首先涉及一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)以大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白。

(2)添加待筛选化合物与Mpro重组蛋白共同孵育。

优选的，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为100～2000nM)与待筛选化合物(浓度为1～ 5mM)按比例混合后，在室温下共同孵育20～60min。

更优选的，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为400nM)与待筛选化合物(浓度为3mM) 按照1:29(v/v)的比例混合后，在室温下共同孵育40min。