[发明专利]一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选模型

权利要求书

1.一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)小分子抑制剂的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)以大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白；

(2)添加待筛选化合物与Mpro重组蛋白共同孵育；

优选的，步骤(2)中，Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为100～2000nM)与待筛选化合物(浓度为1～5mM)按比例混合后，在室温下共同孵育20～60min；

(3)以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和Biotin标记的FITC-Substrate-Biotin多肽(FITC-S-Biotin:FITC-AVLQSGFRKK-Biotin)作为Mpro水解底物，在室温下共同孵育5～60min；

优选的，步骤(3)中，FITC-S-Biotin浓度为20～100nM，加入的FITC-S-Biotin溶液的体积为步骤(2)的体系的1/2～1/1(v/v)。加入FITC-S-Biotin后，室温孵育5～40min；

(4)以亲和素终止水解反应，在室温下共同孵育1～30min，以多功能酶标仪检测mP值；

优选的，步骤(4)中，亲和素浓度为10～500nM，加入的亲和素溶液的体积为步骤(2)的体系的1/6～1/1(v/v)。加入亲和素后，室温孵育1～10min，以多功能酶标仪检测mP值；

(5)绘制目标化合物的抑制曲线，计算目标化合物对新冠病毒主蛋白酶的IC₅₀值；

所述的新冠病毒主蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(2)中：将Mpro重组蛋白溶液(Mpro重组蛋白的浓度为400nM)与待筛选化合物(浓度为3mM)按照1:29(v/v)的比例混合后，在室温下共同孵育40min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(3)中：FITC-S-Biotin浓度为60nM，加入的FITC-S-Biotin溶液的体积为步骤(2)体系的2/3(v/v)。加入FITC-S-Biotin后，室温孵育20min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(4)中：亲和素浓度为300nM，加入的亲和素溶液的体积为步骤(2)体系的1/3(v/v)。加入亲和素后，室温孵育5min，以多功能酶标仪检测mP值。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的大肠杆菌原核表达方法制备高活性Mpro重组蛋白的方法为：

①将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Mpro基因片段连接到pET-21a(+)表达载体中，构建重组质粒Mpro-pET-21a；

②再将重组质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，进行Mpro可溶表达，以HisTrap亲和层析柱分离纯化新冠病毒Mpro重组蛋白。

6.根据权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于，

步骤(5)所述的绘制目标化合物抑制曲线的步骤中，其抑制率的计算公式如下：

。

7.一种用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的荧光偏振筛选试剂盒，所述的试剂盒中包含：

(1)检测有效量的新冠病毒Mpro重组蛋白、荧光探针FITC-S-Biotin、亲和素；

(2)必要的溶剂与试剂。

8.权利要求7所述的用于筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的荧光偏振筛选试剂盒在筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂中的应用。