[发明专利]一种动物源性成分检测方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物源性成分检测方法及其应用，该方法包括以下步骤：（1）构建数据库，（2）样品DNA提取，（3）Cytb基因序列扩增，（4）MiSeq测序及测序分析。本发明提供的一种动物源性成分检测方法，该检测方法对提取的样品DNA直接进行高通量测序分析，保证了足够的数据量，设计通用引物能同时确定掺有几个不同品种的肉制品，并能确定每个品种在肉制品中的相对含量，实现未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定；该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、操作简单、检测时间短，采用该方法可以解决肉制品中不可预见动物源性成分难以同时鉴定的技术难题，解决肉制品食用安全问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物源性成分检测方法及其应用。

背景技术

食品安全关系着人们身体健康，关系着人民幸福感的提高。当前，食源性病原菌污染、农药及兽药残留等是食品安全中人们最普遍关注的问题。而随着人们生活水平的日益提高，未来的食品安全问题更多地表现为对食品的质量、品质、营养性等的监控。其中，对食品物种的鉴定是关系食品安全、质量、品质和营养性等各方面控制的重要科学问题。

随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉类的需求日益增加，品种选择越来越丰富。然而，近年来国内外肉类掺假事件频发，巨大的价格差异驱动着一些不法经营者以低价肉替代高价肉而未在标签上注明来降低成本。从近年来屡次曝光的羊肉掺假，到2013年欧洲的“马肉丑闻”，再到2014年国内沃尔玛的“驴肉掺假门”，各种肉类掺假的事件层出不穷。这不仅严重侵害了消费者利益，而且更严重的是造成恶劣的社会影响，对整个肉类产业也会造成巨大伤害。同时，严重的国际肉类食品掺假情况给我国带来了极大的安全隐患。在西方，一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符的现象，肉制品质量安全已成为全社会共同关注的热点话题。现今，我国对这些“掺假肉”的制作加工没有任何标准可循。

一直以来，国内外众多学者也对动物源性成分的检测技术进行了大量的研究，现阶段可用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体(mtDNA)上，包括细胞色素b(Cytb)基因、细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。目前，国内外用于肉制品的掺假、掺杂检验以PCR-RFLP、多重PCR、实时定量PCR等方法为主。但是，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法全面分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，当遇到几个不同品种的混合样品时，要确定每个品种在混合物中的相对量需要找到品种中唯一的已知目标序列作为参考序列，而且要获得精确的测定结果非常困难，难以满足高效快速、批量大、大规模、操作简单等检测需求。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供的一种动物源性成分检测方法及其应用，该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、检测时间短，能够解决同时测定几个不同品种的混合样品的难题，实现对未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定。

为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种动物源性成分检测方法，包括以下步骤：

（1）构建数据库；

（2）样品DNA提取；

（3）Cytb基因序列扩增；

（4）MiSeq测序及测序分析；

所述步骤（1）构建数据库的方法如下：

a1. 收集物种完整的Cytb基因fasta序列；

b1. 将这些序列及对应的taxonomy信息整合成fasta格式的文件，然后转换成数据库dat格式；

c1. 在MiSeq Reporter Metagenomics中设置并导入数据库；所述数据库包含186个属，476个种的动物Cytb基因序列信息；

所述步骤（3）Cytb基因序列扩增方法如下：

a2. 设计引物Cytb-F和Cytb-R扩增各样品的短片段序列；其中，