[发明专利]一种动物源性成分检测方法及其应用

权利要求书

1.一种动物源性成分检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）构建数据库；

（2）样品DNA提取；

（3）Cytb基因序列扩增；

（4）MiSeq测序及测序分析；

所述步骤（1）构建数据库的方法如下：

a1. 收集物种完整的Cytb基因fasta序列；

b1. 将这些序列及对应的taxonomy信息整合成fasta格式的文件，然后转换成数据库dat格式；

c1. 在MiSeq Reporter Metagenomics中设置并导入数据库；所述数据库包含186个属，476个种的动物Cytb基因序列信息；

所述步骤（3）Cytb基因序列扩增方法如下：

a2. 设计引物Cytb-F和Cytb-R扩增各样品的短片段序列；其中，

引物Cytb-F: 5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’

引物Cytb-R: 5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’

b2. PCR反应体系为20μL，其中Premix Taq 12.5μL、正反向引物10μM各0.5μL、模板DNA1μL、超纯水5.5μL，PCR反应程序先后采用降落PCR{95℃，3min；3循环（95℃，30s；62℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；60℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；58℃，30s；72℃，10s）；26循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30 s；53℃，30s；72℃，10s）72℃，7min}，得到PCR产物；

c2. 将得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小为100 ~350bp，用AMPure XP beads纯化各样品PCR产物。

2.根据权利要求1所述的动物源性成分检测方法，其特征在于：所述步骤（2）样品DNA提取的方法为：将肉类样品匀浆粉碎，称取1mg样品用基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA。

3.根据权利要求1所述的动物源性成分检测方法，其特征在于：所述步骤（4）MiSeq测序及测序分析步骤为：

a3. 在扩增引物的5’端加入接头和测序用引物序列，再通过有限循环PCR加入Illumina测序接头和标签序列以区分不同样品；

b3. 用Nextera XT Index Kit进行PCR扩增加入测序标记，PCR反应体系为50μL，包括Premix Taq 25μL、Nextera XT Index正反向引物各5μL，模板DNA5μL、超纯水10μL，PCR 反应条件为95℃3min；8循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃5min，得到样品PCR产物；

c3. 用AMPure XP beads纯化各样品PCR产物，通过Qubit^® Fluorometer对PCR产物定量分析，并统一稀释成4nM，将各样品以及PhiX Control一同构成测序样品文库，变性处理后，采用MiSeq Reagent Kit v2 (500-cycles)试剂盒上机测序；

d3. 测序结束后，通过MiSeq Reporter Metagenomics分析得到样品成分及组分结果。

4.根据权利要求1所述的动物源性成分检测方法，其特征在于：所述的引物Cytb-F和引物Cytb-R的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1～3任一项所述的动物源性成分检测方法在肉制品掺假、掺杂检验中的应用。