[发明专利]一种快速筛选耐重金属Cd/Cr微生物的方法

说明书

本发明提供了一种快速筛选耐重金属Cd/Cr微生物的方法，包括：(1)将重金属污染的土壤样品配制成土壤悬浊液涂布于含Cd/Cr的LB固体培养基平板上，得到耐Cd/Cr的菌株；(2)将形态差异明显的菌株分别接种在LB固体培养基平板上进行纯化培养；(3)纯化后得到的单一菌株分别接种于加有含Cd/Cr的LB液体培养基的96孔板中，利用酶标仪在不同时刻监测菌株的OD₆₀₀。本发明采用Tecan infinite 200酶标仪和96孔板联合使用的方法，使用微量的实验药品快速分离培养对Cd/Cr具有高效去除作用的菌种，并能实时监测菌株对Cd/Cr去除能力的大小，减少了不必要的浪费以及污染问题，大大提高实验效率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速筛选耐重金属Cd/Cr微生物的方法。

背景技术

近年来随着农业、工业的迅速发展，环境污染问题日益严重。其中，污水、大气、固废及农资等方面的影响会造成土壤重金属含量持续上升，最终导致严重的土壤重金属污染问题。2014年我国环境保护部和国土资源部联合发布《全国土壤污染状况调查公报》，《公报》显示：全国土壤总的点位超标率为16.1％，而我国耕地土壤点位超标率更高达19.4％，估算受污染的耕地面积约3.5亿亩，已对我国保护18亿亩耕地“红线”造成威胁。土壤重金属含量超标，会对农产品产生巨大破坏，最终危害到人类生命健康安全。在污染土壤的诸多种重金属中，Cd和Cr对土壤生态环境的危害巨大，均被称为五毒元素，尤其是Cd，因其移动性大、毒性高、污染面积较广被称为“五毒之首”。

目前，修复重金属污染土壤的方法有物理法、化学法和生物法等，但物理法和化学法大多具有成本高、工作量大、土壤改变的不可逆性、破坏土壤土著菌群以及可能产生二次污染等缺陷，而生物修复技术具有高效率、生态环境友好、成本低廉等优点。近年来，重金属污染土壤的植物-微生物联合修复技术受到各界广泛关注。其中，污染土壤中的土著微生物往往具有较高的重金属抗性，从中分离的微生物由于适应当地的自然环境，能有效修复重金属污染，因此具有更高的经济效益和生态效益。筛选出对气候环境和土壤条件适应性强的、与植物修复相协调的、作用效果好的微生物，为重金属污染土壤的生物修复提供丰富可选的微生物材料，对未来生物修复技术的发展具有重大意义。

目前耐Cd/Cr微生物筛选的方法普遍分为以下几步：(1)将重金属污染土壤样品制成土壤悬浊液，取上清液均匀涂布到含有一定浓度Cd/Cr的固体培养基平板上，放于生化培养箱中恒温培养；(2)将形态差异较大的菌株分离并纯化培养；(3)配制不同Cd/Cr浓度梯度(均高于(1)中的重金属浓度)的培养基，将纯化后的菌株接种于不同Cd/Cr浓度梯度培养基上，比较不同菌株间对Cd/Cr耐性的强弱；(4)将筛选出的菌株接种于一定浓度Cd/Cr的液体培养基中，并在培养的不同时间提取培养基上清液检测剩余Cd/Cr浓度，从而比较不同菌株间对Cd/Cr去除能力的大小。

然而，目前耐Cd/Cr微生物筛选的方法还存在以下问题：

1.实验中为了在不同培养时间下尽可能多次的提取液体培养基上清液检测剩余Cd/Cr浓度，往往需要大量的液体培养基和重金属溶液，浪费成本并产生不必要的污染，且这些重金属溶液具有毒性，对研究人员的身体健康十分有害；

2.培养的菌株数量多，提取培养基上清液需要时间，难以在同一时间提取到所有培养基上清液，提取时间上的差异会导致检测结果不能准确比较不同菌株对重金属的去除能力；

3.对提取的培养基上清液进行消煮需要用到大量的酸，不仅浪费成本，而且在加热消煮过程中，会有酸蒸汽挥发，造成大量污染，消煮步骤繁琐，费时费力；

4.测定培养基上清液重金属浓度需要用到精密仪器(如：ICP-MS等)，而精密仪器的分析对仪器的精度、标准溶液的配制以及研究人员的操作均有较高的要求，且分析过程需要耗费大量时间和人力财力。

为了科学认识微生物在重金属污染土壤的环境中的作用，有必要优化现有方法，进而从重金属污染的土壤中快速分离出对Cd和Cr具有高效去除作用的菌种。