[发明专利]一种评估天然蜂花粉及发酵蜂花粉致敏性的方法

权利要求书

1.油质蛋白和谷氧还蛋白在蜂花粉致敏性评价中作为评价指标的应用，其特征在于，所述蜂花粉为天然蜂花粉或发酵蜂花粉；

所述油质蛋白的氨基酸序列为QASIFSRFFRMFSFIFPFVNVIKLIIASVTSLVCLAFSCVALGGSAVALIVSTPLFIMFSPILVPATIATTLLASGLMAGTTLGLTGIGLIMGLVRTAGGVSLLQSPLRKIIVNRIKARLGGGGGGSRLARLKKILGLLNKLRGMGAGGAAAPAAEPAPAAEAAPAAEAAPAAAPAAAPAAAP；

代表性肽段为TAGGVSLLQSPLR；

所述谷氧还蛋白的氨基酸序列为MAMQKAKEIVSGNAVVVFSKSFCPYCVRVKELLQQLGAKFIAVELDKESDGSQVQSALAEWTGQRTVPNVFIGEKHIGGCDSVTNLHRDGKLVPMLTEAGAIAATAGTTSA；

代表性肽段为AKEIVSGNAVVVFSK。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蜂花粉为天然油菜蜂花粉或发酵油菜蜂花粉。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵油菜蜂花粉是指经酵母菌和/或乳酸菌发酵制得的油菜蜂花粉。

4.一种蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，以权利要求1所述的油质蛋白和谷氧还蛋白作为评价指标；所述蜂花粉为天然蜂花粉或发酵蜂花粉。

5.根据权利要求4所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，利用蛋白组学技术检测样品蜂花粉的蛋白提取物中油质蛋白和谷氧还蛋白的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性。

6.根据权利要求5所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；

所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1。

7.根据权利要求6所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述蛋白组学检测条件为：

所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；

富集柱和分析柱均为反相C18柱；

色谱条件设置如下：

流动相流速为350 nL/min，流动相A为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；

流动相洗脱梯度设置如下：

质谱条件设置如下：

一级全扫描：

离子源为电喷雾离子源ESI，喷雾电压为2.3 kV，离子传输管温度为275℃，S-Lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z；

二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子；

二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离HCD，能量为30 %。

8.根据权利要求7所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述质谱检测及分析还包括：

根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用Uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；

根据蛋白质氨基酸序列，利用AllergenOnline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得油质蛋白和谷氧还蛋白的特征肽段；

通过DNAStar软件根据油质蛋白和谷氧还蛋白的一级序列进行抗原表位分析。

9.根据权利要求8所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括：利用代谢组学技术检测蜂花粉甲醇提取物中的寡肽和氨基酸，并根据检测结果进一步评价蜂花粉的致敏性。

10.根据权利要求9所述的蜂花粉致敏性的评价方法，其特征在于，所述代谢组学检测条件为：

流动相A：含质量分数0.1%甲酸的水溶液；

流动性B：含质量分数0.1%甲酸的乙腈；

流速：0.3 mL/min；

流动相梯度设置如下：

质谱参数设置如下：

正离子模式下毛细管电压，3.5 kV；

负离子模式下毛细管电压，3.0 kV；

碎裂电压，135 V；

干燥气温度，325℃；

干燥气流速，10 L/min；

喷雾电压，35 psi；

鞘气温度，370℃；

鞘气流速，12 L/min；

碰撞能，20 eV；

质谱范围，100-1700 m/z；

氮气用于干燥、雾化和碰撞。